3528 重组人表皮生长因子生物学活性测定法

3528 重组人表皮生长因子生物学活性测定法
（细胞增殖法/MTT比色法）
本法系依据重组人表皮生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞（BALB/c 3T3细胞）的生长具有刺激作用，BALB/c 3T3细胞的生长状况因重组人表皮生长因子生物学活性的不同而异，以此检测重组人表皮生长因子的生物学活性。
试剂 （1）RPMI1640培养液 取RPMI1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素10⁵IU和链霉素10⁵IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
（2）维持培养液 量取新生牛血清4μl，加RPMI1640培养液至1000ml。
（3）完全培养液 量取新生牛血清100ml，加RPMI1640培养液至1000ml。
（4）PBS 称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
（5）噻唑蓝（MTT）溶液 称取MTT粉末0.10g，加PBS20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
标准品溶液的制备 取重组人表皮生长因子标准品，按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每1ml含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备 将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每1ml约含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2孔。以上操作在无菌条件下进行。
测定法 BALB/c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×10⁵~5.0×10⁵个细胞，传代后24~36小时用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0×10⁴~8.0×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液，于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养64~72小时。每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜100μl，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：