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3119 高分子结合物含量测定法

本法系利用高分子结合物、低分子结合物及游离多糖在不同乙醇浓度下,沉淀分离,采用紫外-可见分光光度法测定磷含量,计算高分子结合物的含量。
试剂 (1) 5mol/L氯化钠溶液 精密称定氯化钠29.22g,加水溶解并稀释至100ml,室温保存。
(2)1.5mol/L硫酸 于1体积98%的硫酸中加入11体积的水,混匀。
(3)2.5%钼酸铵 称取钼酸铵2.65g,加水溶解并稀释至100ml。
(4)10%抗坏血酸 称取抗坏血酸10g,加水溶解并稀释至100ml。
(5)矿化试剂 硫酸与70%高氯酸等体积混合制得。
(6)产色试剂 水、1.5mol/L硫酸、2.5%钼酸铵、10%抗坏血酸,按2:1:1:1体积比混合配制。
(7)8μg/ml磷对照品贮备液 精密称定经100℃干燥的磷酸氢二钠0.3665g或磷酸二氢钾0.3509g,加水500ml、5mol/L硫酸溶液10ml溶解,补加水至1000ml。临用时,将贮备液做20倍稀释,即为磷对照品工作液。
(8)1.0mol/L氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠,加水溶解并稀释至100ml。
供试品溶液的制备 (1)分步沉淀 原液用生理氯化钠溶液稀释至多糖含量20~28μg/ml或成品疫苗3ml,加入5mol/L氯化钠溶液0.75ml,混匀后加入无水乙醇15ml,于-20℃冰箱放置72~96小时,以每分钟8000转4℃离心90分钟,吸取上清液为供试品溶液2;于沉淀中加入50%乙醇溶液0.5ml,加玻璃珠,混合后室温放置1小时;再加入50%乙醇溶液1.5ml,混合后室温放置2小时,然后以每分钟8000转8℃离心1小时,吸取1.8ml上清液为供试品溶液3;沉淀再加入1.0mol/L氢氧化钠溶液0.5ml,混合后室温放置1小时,加水1.25ml,作为供试品溶液4。
(2)取多糖含量20~28μg/ml的原液或成品疫苗1.0ml为供试品1。
(3)供试品溶液的矿化 分别量取1.0ml供试品1、1.5ml供试品溶液2、0.7ml供试品溶液3、0.5ml供试品溶液4各2份;分别加入矿化试剂0.15ml,置150℃干燥1小时,然后升温至180℃干燥30分钟,再升温至250℃干燥1小时。
测定法 量取水1.95ml,加矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂,混匀后置37℃水浴2小时,在波长825nm处测定吸光度,作为空白对照。
于矿化好的供试品溶液中加水1.85ml,加产色试剂 2.0ml,混匀后置37℃水浴2小时,在波长825nm处测定吸光度。
分别量取磷对照品工作液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml于试管中,每管依次加水1.85ml、1.75ml、1.55ml、1.15ml、0.95ml;然后每管分别加入矿化试剂 50μl后加2.0ml产色试剂,混匀后置37℃水浴2小时,在波长825nm处测定吸光度。
结果计算 以磷对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归,求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程,求出磷含量。
关键字:3119 高分子
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