3530 鼠神经生长因子生物学活性测定法

3530 鼠神经生长因子生物学活性测定法
第一法 鸡胚背根神经节培养法
试剂 （1）鼠尾胶 大鼠鼠尾用75%乙醇消毒后，分离出尾腱，剪碎，浸泡于0.1%冰醋酸溶液中溶解48小时，4℃，每分钟4000转离心30分钟，取上清液，-20℃保存。
（2）DMEM培养液 取DMEM培养液，加入终浓度为100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺，混匀。
（3）基础培养液 量取胎牛血清（FBS）10ml，加DMEM培养液90ml，4℃保存。
标准品溶液和供试品溶液的制备 取鼠神经生长因子生物学活性测定的国家标准品，用DMEM培养液做3倍系列稀释，共5~6个稀释度。取供试品做相同稀释。
测定法 取7~9天的鸡胚，洁净条件下取出背根神经节，分置于涂有鼠尾胶的培养瓶中，贴壁1~2小时后，加入不同稀释度的标准品溶液和供试品溶液，并设阴性对照瓶，于37℃、含5%二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养24小时，用倒置显微镜观察神经节轴突生长情况，以引起++++生长的最高稀释度为判定终点，按下式计算供试品的生物学活性单位。

【附注】神经节轴突生长判定标准
“#”：神经节生长过量抑制；
“++++”：神经节突起长满四周，又长又密，呈树杈状；
“+++”：神经节突起长满2/3周，呈树杈状；
“++”：神经节突起长满1/2周；
“+”：神经节突起只有几根；
“-”无突起生长。
第二法 TF-1细胞/MTS比色法
本法系依据人红细胞白血病细胞（简称TF-1细胞）的生长状况因鼠神经生长因子（NGF）生物学活性的不同而不同，以此检测NGF的生物学活性。本法为仲裁法。
试剂 （1）RPMI1640培养液 取市售RPMI1640培养液，加入终浓度为100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素。
（2）基础培养液 量取胎牛血清（FBS）100ml，加入RPMI1640培养液900ml中。4℃保存。
（3）完全培养液 基础培养液添加鼠神经生长因子至终浓度为每1ml含12U。
（4）MTS溶液 取市售的MTS于4℃融化，1.2ml/支分装到EP管中，并避光保存于-20℃。
（5）TF-1细胞 TF-1细胞株用完全培养基于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×10⁵~5.0×10⁵个细胞，传代后24小时用于NGF生物学活性测定。
标准品溶液的制备 取鼠神经生长因子生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后，用基础培养液稀释至每1ml含100U或适宜浓度（每步稀释不超过10倍）。在96孔细胞培养板中，做3倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留100μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在洁净条件下进行。
供试品溶液的制备 将供试品揆标示量复溶后，用基础培养液稀释至每1ml约含100U（每步稀释不超过10倍）。在96孔细胞培养板中，做3倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留100μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在洁净条件下进行。
测定法 TF-1细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×10⁵~5.0×10⁵个细胞，传代后24小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量TF-1细胞培养物，离心收集TF-1细胞，用基础培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成每1ml含6.0×10⁴个细胞的细胞悬液，置于37℃、5%二氧化碳条件下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液100μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养66~72小时。每孔加入MTS溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养3小时。以上操作在无菌条件下进行。放入酶标仪，以550nm为参比波长，在波长490nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：