3427 人血小板抗体测定法

3427 人血小板抗体测定法
本法系采用血小板与血小板抗体结合后，使血小板发生凝集的原理，通过比较凝集反应终点测定供试品中人血小板抗体效价。
试剂 （1）5%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝剂 称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄?12H₂O）0.365g、磷酸二氢钾0.875g、氯化钠2.125g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂?2H₂O）12.5g，加水溶解并稀释至250ml。
（2）0.33%EDTA溶液 称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄?12H₂O）0.73g、磷酸二氢钾1.75g、氯化钠4.25g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂?2H₂O）1.65g、加水溶解并稀释至500ml。
（3）血小板稀释液 取3人份以上AB型血清混合，56℃灭能30分钟，按AB型血清每100ml加硫酸钡50g的比例加入硫酸钡，置37℃吸附1小时，随时搅动，然后以每分钟3000转离心30分钟，弃去沉淀，吸上清液备用。试验当天按1份血清加3份生理氯化钠溶液配成血小板稀释液（注意AB型血清中不得混有红细胞及溶血）。
（4）血小板悬液的制备 采集人静脉血20ml，按5%EDTA溶液与全血以1：9（体积比）的比例混合，于20℃以每分钟800转离心15分钟，取上层血浆加0.33%EDTA溶液至原全血体积，于20℃以每分钟1500转离心10分钟，弃去上清液，如此再重复用0.33%EDTA洗涤2次，弃上清液，向沉淀中加血小板稀释液0.5ml，混匀，计数并将血小板浓度调至2.5×10⁵~3.5×10⁵/mm³即可（注意：计数时血小板悬液应在计数板上静置2~3分钟，并在10分钟内计数完）。
供试品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将供试品做2倍系列稀释至1：16。
阳性对照溶液的制备 取经人血小板免疫的猪血浆（或兔血清）0.5ml，60℃灭能10分钟，用硫酸钡0.05g于37℃；吸附15分钟后，以每分钟3000转离心20分钟，取上清液备用。
阴性对照溶液的制备 生理氯化钠溶液及血小板稀释液。
测定法 量取不同稀释度供试品溶液各0.1ml，分别加血小板悬液0.1ml，于37℃保温30分钟后，滴到计数板上，静置2~3分钟，在20~40倍显微镜下观察结果。本试验同时设阴性对照、阳性对照组。
（1）阳性对照 取阳性对照溶液0.1ml，自“加血小板悬液0.1ml”起，同法操作。
（2）阴性对照 取阴性对照溶液0.1ml，自“加血小板悬液0.1ml”起，同法操作。
结果判定 阳性对照为“++”；阴性对照为“-”；试验成立。以“+”为判定终点，即以供试品出现“+”的最高稀释度为该供试品的血小板抗体效价。
【附注】 （1）“-”无凝块或偶见2~3个血小板成串。
（2）“+”小凝块，3~5个血小板凝集，游离血小板少。
（3）“++”大凝块，6个以上血小板聚集，几乎无游离血小板.