0541 电泳法

0541 电泳法
电泳是指溶解或悬浮于电解液中的带电荷的蛋白质、胶体、大分子或其他粒子，在电流作用下向其自身所带电荷相反的电极方向迁移。电泳法是指利用溶液中带有不同量电荷的阳离子或阴离子，在外加电场中使供试品组分以不同的迁移速度向对应的电极移动，实现分离并通过适宜的检测方法记录或计算，达到测定目的的分析方法。电泳法一般可分为两大类：一类为自由溶液电泳或移动界面电泳，另一类为区带电泳。
移动界面电泳是指不含支持物的电泳，溶质在自由溶液中泳动，故也称自由溶液电泳，适用于高分子的检测。区带电泳是指含有支持介质的电泳，带电荷的供试品（如蛋白质、核苷酸等大分子或其他粒子）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，在电场的作用下，向其极性相反的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带。区带电泳法可选用不同的支持介质，并用适宜的检测方法记录供试品组分电泳区带图谱，以计算其含量（％）。除另有规定外，各不同支持介质的区带电泳法，照下述方法操作。采用全自动电泳仪操作时，参考仪器使用说明书进行；采用预制胶的电泳时，参考各电泳仪标准操作规程进行；结果判断采用自动扫描仪或凝胶成像仪时，参考仪器使用说明书进行。
第二法 醋酸纤维素薄膜电泳法
醋酸纤维素薄膜电泳法以醋酸纤维素薄膜作为支持介质。介质孔径大，没有分子筛效应，主要凭借被分离物中各组分所带电荷量的差异进行分离，适用于血清蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、类固醇激素及同工酶等的检测。
1.仪器装置
电泳室及直流电源同纸电泳（四部通则0541）。
2.试剂
（1）巴比妥缓冲液（pH8.6） 取巴比妥2.76g、巴比妥钠15.45g，加水溶解使成1000ml。
（2）染色液 常用的有以下几种，可根据需要，按各品种项下要求使用。
①氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
②丽春红染色液 取丽春红9.04g、三氯醋酸6g，用水溶解并稀释至100ml。
③含有醋酸的丽春红染色液 取丽春红0.1g，醋酸5ml，用水制成100ml的溶液。4℃保存。
④含有三氯醋酸和5-磺基水杨酸的丽春红染色液 取丽春红2g，三氯醋酸30g，5-磺基水杨酸30g，用水溶解并稀释至100ml。
（3）脱色液 取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。
（4）透明液 取冰醋酸25ml，加无水乙醇75ml，混匀。
3.测定法
（1）醋酸纤维素薄膜 取醋酸纤维素薄膜，裁成2cm×8cm的膜条，将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液（pH8.6）中，待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液后，将膜条无光泽面向上，置电泳槽架上，经滤纸桥浸入巴比妥缓冲液（pH8.6）中。
（2）点样与电泳 于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白质含量约5%的供试品溶液2～3μl，一般应在10～12V/cm稳压或0.4～0.6mA/cm［总电流量=电流量（mA/cm）×每条膜的宽度（cm）×膜条数］稳流条件下电泳至区带距离4～5cm为宜（执行《中国药典》三部的生物制品一般采用稳流条件）。
人血白蛋白与免疫球蛋白类样品，在测定时取新鲜人血清作对照，电泳时间以白蛋白与免疫球蛋白之间的电泳展开距离约2cm为宜。
（3）染色 电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑或丽春红染色液中，2～3分钟后，用脱色液浸洗数次，直至脱去底色为止。
（4）透明 将洗净并完全干燥后的膜条浸于透明液中，一般浸泡10～15分钟，待全部浸透后，取出平铺于洁净的玻璃板上，干后即成透明薄膜，可用于相对含量、纯度测定和作标本长期保存。
（5）含量测定未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各品种项下规定的方法测定，一般采用洗脱法或扫描法，测定各蛋白质组分的相对含量（％）。
洗脱法 将洗净的膜条用滤纸吸干，剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳区带，分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中，振摇数次，至洗脱完全，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在各品种项下规定的检测波长处测定洗脱液的吸光度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白质部位，同法操作作为空白对照。先计算吸光度总和，再计算各蛋白质组分所占比率（％）。
扫描法 将干燥的醋酸纤维素薄膜用薄层色谱扫描仪采用反射（未透明薄膜）或透射（已透明薄膜）方式在记录器上自动绘出各蛋白质组分曲线图，横坐标为膜条的长度，纵坐标为吸光度，计算各蛋白质组分的含量（％）。亦可用微机处理积分计算。
人血白蛋白与免疫球蛋白类样品，以人血清作为对照，按峰面积计算各蛋白质组分的含量（％）。
第三法 琼脂糖凝胶电泳法
琼脂糖凝胶电泳法以琼脂糖作为支持介质。琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型的凝胶。这种网络结构具有分子筛作用，使带电颗粒的分离不仅依赖净电荷的性质和数量，还可凭借分子大小进一步分离，从而提高了分辨能力。本法适用于免疫复合物、核酸与核蛋白等的分离、鉴定与纯化。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA>直线DNA>开环双链DNA。适用于检测DNA，PCR反应中的电泳检测，方法见各品种项下。
方法1
1.仪器装置
电泳室及直流电源同纸电泳（四部通则0541）。
2.试剂
（1）醋酸-锂盐缓冲液（pH3.0） 取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，加氢氧化锂固体适量使溶解调节pH值至3.0，再加水至1000ml。
（2）甲苯胺蓝溶液 取甲苯胺蓝0.1g，加水100ml使溶解。
3.测定法
（1）制胶 取琼脂糖约0.2g，加水10ml，置水浴中加热使溶胀完全，加温热的醋酸-锂盐缓冲液（pH3.0）10ml，混匀，趁热将胶液涂布于大小适宜（2.5cm×7.5cm或4cm×9cm）的水平玻璃板上，涂层厚度约3mm，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。
（2）对照品溶液及供试品溶液的制备照各品种项下规定配制。
（3）点样与电泳 在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲液（pH3.0），将凝胶板置于电泳槽架上，经滤纸桥与缓冲液接触。于凝胶板负极端分别点样1μl，立即接通电源，在电压梯度约30V/cm、电流强度1～2mA/cm的条件下，电泳约20分钟，关闭电源。
（4）染色与脱色 取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景无色为止。
方法2
1.仪器装置
电泳室及直流电源同纸电泳（四部通则0541）。
2.试剂
（1）巴比妥缓冲液（pH8.6） 称取巴比妥4.14g、巴比妥钠23.18g，加水适量，加热使之溶解，放冷至室温，再加叠氮钠0.15g，溶解后，加水稀释至1500ml。
（2）1.5%琼脂糖溶液 称取琼脂糖1.5g，加水50ml和巴比妥缓冲液（pH8.6）50ml，加热使完全溶胀。
（3）0.5%氨基黑溶液 称取氨基黑10B 0.5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
（4）脱色液 量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。
（5）溴酚蓝指示液称取溴酚蓝50mg，加水使之溶解，并稀释至100ml。
3.测定法
（1）制胶 取上述1.5%的琼脂糖溶液，趁热将胶液涂布于大小适宜的水平玻璃板上，涂层厚度约3mm，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层，即得。
（2）对照品和供试品溶液
对照品 正常人血清或其他适宜的对照品。
供试品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将供试品稀释成蛋白质浓度为1%～2%的溶液。
（3）点样与电泳 在电泳槽内加入巴比妥缓冲液（pH8.6）；于琼脂糖凝胶板负极端的1/3处打孔，孔径2～3mm，置于电泳槽架上，经3层滤纸搭桥与巴比妥缓冲液（pH8.6）接触。测定孔加适量供试品溶液和1滴溴酚蓝指示液，对照孔加适量对照品及1滴溴酚蓝指示液。100V恒压条件下电泳2小时（指示剂迁移到前沿），关闭电源。
（4）染色与脱色 取下凝胶板，用0.5%氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背景无色。
第五法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。
2.试剂
（1）水（电阻率不低于18.2MΩ·cm）。
（2）A液 1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.8，加水稀释至100ml。
（3）B液 30%丙烯酰胺溶液-0.8% N，N'-亚甲基双丙烯酰胺溶液（避光保存）。
（4）C液 1%十二烷基硫酸钠溶液。
（5）D液 10%N，N，N'，N'-四甲基乙二胺。
（6）E液 10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
（7）F液 0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100ml。
（8）电极缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸钠1g，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.3，加水稀释至1000ml。
（9）供试品缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷0.303g、溴酚蓝2mg、十二烷基硫酸钠0.8g，量取盐酸0.189ml、甘油4ml，加水溶解并稀释至10ml。该缓冲液用于非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。如用于还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则再加β-巯基乙醇2ml。
（10）分子量标准品 所选用的标准品的分子量范围应将供试品的分子量包括在其中。
（11）固定液（蓝染法） 称取三氯醋酸5g，加水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加水至500ml。
固定液（银染A法） 取甲醇250ml、冰醋酸60ml，加水稀释至500ml。
固定液（银染B法） 取甲醇50ml，37%甲醛溶液54μl，加水至100ml。
（12）脱色液（银染A法） 取乙醇100ml、冰醋酸50ml，加水稀释至1000ml。
（13）辅染液（银染A法） 称取重铬酸钾10g，量取硝酸2ml加适量水溶解并稀释至200ml。用前40倍稀释。
（14）银染液（银染A法） 称取硝酸银2.04g，加水溶解并稀释至1000ml。
硝酸银溶液（银染B法） 取硝酸银0.8g，加水至4.0ml，将此溶液滴加到0.1mol/L氢氧化钠溶液20ml与25%氨溶液1.5ml的混合液中，摇匀，用水稀释至100ml。
（15）显色液（银染A法） 称取碳酸钠30g，加适量水溶解，加甲醛0.5ml并稀释至1000ml。
显色液（银染B法） 取1%枸橼酸溶液2.5ml，37%甲醛溶液270μl，加水至500ml。
（16）终止液（银染A法） 取冰醋酸10ml，加水稀释至1000ml。
终止液（银染B法） 取冰醋酸100ml，加水至1000ml。
（17）考马斯亮蓝染色液 称取考马斯亮蓝R250 1g，加入甲醇200ml、冰醋酸50ml、水250ml，混匀。
（18）考马斯亮蓝脱色液 取甲醇400ml、冰醋酸100ml与水500ml，混匀。
（19）保存液 取冰醋酸75ml，加水至1000ml，摇匀。
供试品溶液的制备 将供试品与供试品缓冲液按3：1的比例混匀，或照各品种项下的规定制备，除另有规定外，置水浴中100℃加热3～5分钟；对照品/标准品溶液同法操作。
3.测定法
（1）制备分离胶溶液 根据不同分子量的需要，按下表制成分离胶溶液，灌入模具内至一定高度，加水封顶，室温下聚合（室温不同，聚合时间不同）。

（2）制备浓缩胶溶液 待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶溶液（配方见上表），插入样品梳，注意避免气泡出现。
（3）加样 待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽前后槽，在加样孔中加入供试品溶液与对照品/标准品溶液5μg（银染法）或10μg以上（考马斯亮蓝染色法）。
（4）电泳 垂直板电泳：恒压电泳，初始电压为80V，进入分离胶时调至150～200V，当溴酚蓝迁移胶底处，停止电泳。或恒流电泳，以恒流10mA条件下开始电泳，至供试品溶液进入分离胶后将电流调至20mA，直至电泳结束。
圆盘电泳：调节电流使每管8mA。
（5）固定与染色
①考马斯亮蓝法 电泳完毕，取出胶片（条），置固定液中30分钟，取出胶片（条），置染色液中1～2小时，用脱色液脱色至凝胶背景透明后保存在保存液中。
②银染法 除另有规定外，银染法一般不用于定量试验；做定性试验时，上样量可以适当增加；做纯度试验时，若结果的量效关系不成正比，建议用考马斯亮蓝法染色。
银染A法 将电泳后的凝胶浸入固定液中10～12小时，取出，用脱色液漂洗3次（温度应不低于25℃），每次10分钟；漂洗后的凝胶浸于辅染液中7～10分钟后取出，用水浸洗3次，每次2分钟；将浸洗后的凝胶浸于银染液中，置较强日光或类似光源下照射30分钟，再于室内光线下放置20分钟；将凝胶自银染液中取出，用水浸洗2次，每次1分钟；然后将凝胶浸于显色液中，每隔2分钟换液1次，直至蛋白质条带显色完全；将凝胶浸于终止液中10分钟后，取出凝胶保存于水中。
银染B法 胶片浸在固定液中至少2小时后弃去固定液，用水浸洗至少1小时；胶片置1%戊二醛溶液中15分钟后，用水洗2次，每次15分钟；胶片置硝酸银溶液中15分钟后，用水洗3次，每次15分钟；胶片置显色液中，待各带显出后置终止液中。
4.结果判断
用卡尺或用扫描定位法测量溴酚蓝指示剂和蛋白质迁移距离（如为圆盘电泳还应测量染色前后胶条长度，垂直板电泳胶片厚度低于1mm，染色前后胶片长度基本不变）。按下式计算相对迁移率：

（1）供试品主成分迁移率应与对照品迁移率一致。
（2）分子量以R'_m为横坐标，标准蛋白质的分子量对数值为纵坐标，进行线性回归，由标准曲线求得供试品的分子量。
（3）纯度 取凝胶置薄层扫描仪，以峰面积按归一化法计算。
如使用商品化的SDS-聚丙烯酰胺预制胶电泳系统，生产厂家可能提供不同表面积和厚度的凝胶，为了达到最优的分离度，按厂家推荐的条件进行电泳，电泳时间和电流/电压需要按照厂家说明进行调整。
【注】执行《中国药典》三部的生物制品应采用银染A法。
第六法 等电聚焦电泳法
等电聚焦电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点（此处的pH值使相应的蛋白质不再带电荷）时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质类和肽类供试品等电点的电泳方法。
方法1
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
（1）水 （电阻率不低于18.2MΩ·cm）。
（2）A液 称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
（3）B液 10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
（4）供试品缓冲液（4倍浓度） 取甘油8ml、40%两性电解质（pH3～10）溶液4ml，加水至20ml。加0.1%甲基红溶液20μl。
（5）标准品 所选用的标准品的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。
（6）固定液 称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g，加水溶解并稀释至300ml。
（7）脱色液（平衡液） 取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml，加水稀释至2000ml。
（8）染色液 称取考马斯亮蓝G250（或R250）0.35g，加脱色液300ml，在60～70℃水浴中加热，使溶解。
（9）保存液 取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
（10）正极液（0.01mol/L磷酸溶液） 取磷酸1ml，加水至1800ml。
（11）负极液（0.01mol/L氢氧化钠溶液） 称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并稀释至1000ml。
3.测定法
（1）制胶 装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃纸之间加入60%甘油1ml。取水12ml、甘油2ml、A液4.0ml、两性电解质（pH3～10）溶液（或其他两性电解质）1.0ml，混匀，脱气，再加B液72μl，N，N，N'，N'-四甲基乙二胺3μl，混匀后注入槽内聚合，插入样品梳，注意避免气泡出现。
（2）供试品溶液的制备 将供试品对水透析（或用其他方法）脱盐后，与供试品缓冲液按3：1体积比混匀。供试品溶液最终浓度应不低于0.5mg/ml。或按照各品种项下的方法制备。
（3）电泳 待胶溶液聚合后小心拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽前后槽，样品孔每孔加供试品缓冲液20μl，接通冷却循环水，于10℃、250V（约10mA）条件下电泳30分钟。每孔分别加供试品溶液与标准品溶液各20μl，于10℃、500V（约10mA），上限电压2000V条件下，电泳约3.5小时。
（4）固定与染色 电泳结束后，即将凝胶放入固定液中固定20分钟以上；取出，放入平衡液中20～30分钟；再放入染色液中40～60分钟，然后用脱色液浸洗至背景无色，取出放入保存液中30分钟；亦可做成干胶保存。
4.结果判断
（1）鉴别 供试品主成分迁移距离应与标准品一致。
（2）等电点 以各标准品的等电点（pI）对其相应的迁移距离作线性回归，将供试品的迁移距离代入线性回归方程，求出供试品的等电点。
方法2
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模具。
2.试剂
（1）水（电阻率不低于18.2MΩ·cm）。
（2）A液 称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
（3）B液 10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
（4）标准品 所选用的标准品的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。
（5）固定液 称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g，加水溶解并稀释至300ml。
（6）脱色液（平衡液） 取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml，加水稀释至2000ml。
（7）染色液 称取考马斯亮蓝G250（或R250）0.35g，加脱色液300ml，在60～70℃水浴中加热，使溶解。
（8）保存液 取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
（9）正极液（0.5mol/L磷酸溶液） 量取磷酸50ml，加水至1800ml。
（10）负极液（0.2mol/L氢氧化钠溶液） 称取氢氧化钠8g，加水溶解并稀释至1000ml。
3.测定法
（1）制胶量取A液6.25ml、pH3～10两性电解质（或其他两性电解质）1.5ml、水17.1ml，抽气5～10分钟，加B液175μl和N，N，N'，N'-四甲基乙二胺20μl（根据凝胶速度可适当调整试剂的加入量），混匀后缓慢地注入水平模具内，室温下聚合。将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免产生气泡。
（2）供试品溶液的制备 将供试品对水透析（或用其他方法）脱盐，并使蛋白质或多肽含量调节在每0.5～5mg/ml范围。或按照各品种项下的方法制备。
（3）电泳 用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条，然后分别放于正极与负极上，将加样滤纸放在凝胶上。分别加供试品溶液与标准品溶液各5～30μl。将电极对准电极条的中心，加盖，在上限电压2000V、上限电流50mA、功率为每1cm胶1W、温度4℃的电泳条件下，开始电泳，电泳30分钟后去掉加样滤纸，待电流不再变化时停止电泳。如有必要可在起始电压200V下预电泳30分钟。
（4）固定与染色 同等电聚焦垂直板电泳。
4.结果判断 同等电聚焦垂直板电泳。