0731 蛋白质含量测定法

0731 蛋白质含量测定法
组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链，蛋白质是一条或多条多肽链组成的生物大分子。不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方法学验证，同时应尽可能选用与待测定品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。
第一法 凯氏定氮法
本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量算出含氮量，再将含氮量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
本法灵敏度较低，适用于0.2～2.0mg氮的测定。氮转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中所含氨基酸的结构差异会稍有区别。
供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备，生物制品按如下方法操作。
精密量取供试品（如供试品为冻干制剂或固体粉末时，应复溶后量取）适量，用0.9%氯化钠溶液定量稀释，制成每1ml中含氮量约1mg的溶液，精密量取1ml，作为总氮供试品溶液进行测定。非蛋白氮供试品溶液的制备，除另有规定外，照附注项下钨酸沉淀法操作，即得。
测定法除另有规定外，按测定法（1）操作，生物制品按测定法（2）操作。
（1）本测定法适用于不含无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各品种项下规定的供试品溶液适量，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法（通则0704第二法或第三法）测定供试品溶液的含氮量。除另有规定外，氮转换为蛋白质的换算系数为6.25。
（2）本测定法适用于添加无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。除另有规定外，精密量取各品种项下规定的总氮及非蛋白氮供试品溶液适量，分别置凯氏定氮瓶中，照氮测定法（通则0704第二法或第三法）测定，以总氮量减去非蛋白氮量即为供试品溶液的含氮量。除另有规定外，氮转换为蛋白质的换算系数为6.25。
【附注】非蛋白氮供试品溶液制备常用方法
钨酸沉淀法 精密量取供试品（如供试品为冻干制剂或固体粉末时，应复溶后量取）适量（蛋白质含量不高于0.2g），置20ml量瓶中，加水10ml，加10%钨酸钠溶液2.0ml，0.33mol/L硫酸溶液2ml，加水至刻度。或精密量取上述供试品2ml，加水14.0ml，10%钨酸钠溶液2.0ml，0.33mol/L硫酸溶液2.0ml。摇匀，静置30分钟，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得（可依据蛋白质浓度适当调整10%钨酸钠溶液及0.33mol/L硫酸溶液用量，使钨酸终浓度保持1%）。
三氯醋酸沉淀法 精密量取供试品（如供试品为冻干制剂或固体粉末时，应复溶后量取）适量（蛋白质含量6～12mg），加等体积的10%三氯醋酸溶液，混匀，静置30分钟，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得（可依据蛋白质浓度适当调整10%三氯醋酸溶液用量，使三氯醋酸终浓度保持5%）。
第二法 福林酚法（Lowry法）
本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu²⁺螯合形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法灵敏度高，测定范围为20～250μg。但对本法产生干扰的物质较多，对双缩脲反应产生干扰的离子，同样容易干扰福林酚反应，且影响更大。如还原物质、酚类、枸橡酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
除另有规定外，按方法1操作；如有干扰物质时，除另有规定外，按方法2操作并需经方法学验证。
方法1：
试剂 碱性铜试液 取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合作为乙液。临用前，合并甲、乙液，并加水至500ml。
对照品溶液的制备 除另有规定外，取血清白蛋白（牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每1ml中含0.2mg的溶液。
供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备（蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。
测定法 精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml（对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟，各加入福林酚试液［取福林试液中的贮备液（2mol/L酸浓度）1→16］4.0ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在650nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。
方法2：
测定前将脱氧胆酸盐-三氯醋酸加入样品中，通过将蛋白质沉淀来去除干扰物质。这种方法也可用于将稀溶液中的蛋白质浓集。
试剂 试液A 取1%氢氧化钠溶液200ml与5%碳酸钠溶液200ml混合，加水稀释至500ml。
试液B 取2.98%二水合酒石酸二钠溶液100ml与1.25%硫酸铜溶液100ml混合，加水稀释至250ml，临用新制。
试液C 取试液A与试液B按50：1的比例混合，临用新制。
福林酚试液 取福林试液中的贮备液（2mol/L酸浓度）1→2（所配得的福林酚试液应满足以下要求：取供试品溶液1ml，加试液C 5ml和配好的福林酚试液0.5ml，所得溶液的pH值应为10.3±0.3。若溶液pH值超出范围，应适当调整福林酚试液的稀释倍数）。
去氧胆酸钠试液 取去氧胆酸钠适量，加水制成每1ml中含1.5mg的溶液。
对照品溶液的制备 除另有规定外，取血清白蛋白（牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品适量，加水分别制成每1ml中含0.00mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg的溶液（对照品溶液浓度可在本法测定范围内进行适当调整）。
供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备（蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。
测定法 精密量取各对照品溶液1.0ml，分别置玻璃试管中，加入去氧胆酸钠试液0.1ml，涡旋混匀，室温放置10分钟，加入72%三氯醋酸溶液0.1ml，涡旋混匀，在3000g条件下离心30分钟，轻轻倒出上清液，用吸管将剩余液体移除。蛋白质沉淀用试液C 1ml复溶后，再加入试液C 5ml，混匀，室温放置10分钟，加入福林酚试液0.5ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在750nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液1.0ml，同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。
第三法 双缩脲法
本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu²⁺形成紫红色络合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法快速、灵敏度低，测定范围通常可达1～10mg。本法干扰测定的物质主要有硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和某些氨基酸等。
试剂 双缩脲试液 取硫酸铜1.5g、酒石酸钾钠6.0g和碘化钾5.0g，加水500ml使溶解，边搅拌边加入10%氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混匀，即得。
对照品溶液的制备 除另有规定外，取血清白蛋白（牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每1ml中含10mg的溶液。
供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备（蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。
测定法 精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml（对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加入双缩脲试液4.0ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在540nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法操作。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。
第四法 2，2'-联喹啉-4，4'-二羧酸法（BCA法）
本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu²⁺还原为Cu⁺，2，2'-联喹啉-4，4'-二羧酸（BCA）与Cu⁺结合形成紫色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法灵敏度较高，测定范围可达80～400μg。本法测定的供试品中不能有还原剂和铜螯合物，否则干扰测定。
试剂 铜-BCA试液 取2，2'-联喹啉-4，4'-二羧酸钠1g，无水碳酸钠2g，酒石酸钠0.16g，氢氧化钠0.4g与碳酸氢钠0.95g，加水使溶解成100ml，调节pH值至11.25，作为甲液；另取4%硫酸铜溶液作为乙液。临用前取甲液100ml，加入乙液2ml，混匀，即得。
对照品溶液的制备 除另有规定外，取血清白蛋白（牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每1ml中含0.8mg的溶液。
供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备（蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。
测定法 精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml（对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管中，各加水至0.5ml，再分别加入铜-BCA试液10.0ml，立即混匀，置37℃水浴中保温30分钟，放冷，照紫外-可见分光光度法（通则0401），立即在562nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。
第五法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质分子中的碱性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸结合形成蓝色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
本法灵敏度高，通常可测定1～200μg的蛋白质量。本法主要的干扰物质有去污剂、Trito n X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等，供试品缓冲液呈强碱性时也会影响显色。
试剂 酸性染色液 取考马斯亮蓝G250 0.1g，加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀释至1000ml，混匀。滤过，取滤液，即得。本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前需经滤过。
对照品溶液的制备 除另有规定外，取血清白蛋白（牛）对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每1ml中含1mg的溶液。
供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备（蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致）。
测定法 精密量取对照品溶液0.0ml、0.01ml、0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml（对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管中，各加水至0.1ml，再分别加入酸性染色液5.0ml，立即混匀，照紫外-可见分光光度法（通则0401），立即在595nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法测定，从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。
【附注】本法测定时不可使用可与染色物结合的比色皿（如石英比色皿），建议使用玻璃比色皿或其他适宜材料的比色皿。
第六法 紫外-可见分光光度法
本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，其在280nm波长处具最大吸光度，在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。
本法操作简便快速，适用于纯化蛋白质的检测，一般供试品浓度为0.2～2mg/ml。本法准确度较差，干扰物质多。测定法（2）适用于供试品溶液中存在核酸时的蛋白质测定。
对照品溶液与供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备。
测定法 （1）取供试品溶液，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在280nm的波长处测定吸光度，以吸收系数法或对照品比较法计算供试品中蛋白质的含量。
（2）取供试品溶液，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在280nm与260nm的波长处测定吸光度，按下式计算供试品中蛋白质的含量。
蛋白质浓度（mg/ml）=1.45×A₂₈₀-0.74×A₂₆₀