0431 质谱法

0431 质谱法
质谱法是使待测化合物产生气态离子，再按质荷比（m/z）将离子分离、检测的分析方法，检测限可达10^-15～10^-12mol数量级。质谱法可提供分子质量和结构的信息，定量测定可采用内标法或外标法。
质谱仪的主要组成如图所示。在由泵维持的约10^-3～10^-6Pa真空状态下，离子源产生的各种正离子（或负离子），经加速，进入质量分析器分离，再由检测器检测。计算机系统用于控制仪器，记录、处理并储存数据，当配有标准谱库软件时，计算机系统可以将测得的质谱与标准谱库中图谱比较，获得可能化合物的组成和结构信息。

图 质谱仪的主要组成
一、进样系统
样品导入应不影响质谱仪的真空度。进样方式的选择取决于样品的性质、纯度及所采用的离子化方式。
1.直接进样
室温常压下，气态或液态化合物的中性分子通过可控漏孔系统，进入离子源。吸附在固体上或溶解在液体中的挥发性待测化合物可采用顶空分析法提取和富集，程序升温解吸附，再经毛细管导入质谱仪。
挥发性固体样品可置于进样杆顶端，在接近离子源的高真空状态下加热、气化。采用解吸离子化技术，可以使热不稳定的、难挥发的样品在气化的同时离子化。
多种分离技术已实现了与质谱的联用。经分离后的各种待测成分，可以通过适当的接口导入质谱仪分析。
2.气相色谱-质谱联用（GC-MS）
在使用毛细管气相色谱柱及高容量质谱真空泵的情况下，色谱流出物可直接引入质谱仪。
3.液相色谱-质谱联用（LC-MS）
使待测化合物从色谱流出物中分离、形成适合于质谱分析的气态分子或离子需要特殊的接口。为减少污染，避免化学噪声和电离抑制，流动相中所含的缓冲盐或添加剂通常应具有挥发性，且用量也有一定的限制。
（1）粒子束接口 液相色谱的流出物在去溶剂室雾化、脱溶剂后，仅待测化合物的中性分子被引入质谱离子源。粒子束接口适用于分子质量小于1000道尔顿的弱极性、热稳定化合物的分析，测得的质谱可以由电子轰击离子化或化学离子化产生。电子轰击离子化质谱常含有丰富的结构信息。
（2）移动带接口 流速为0.5～1.5ml/min的液相色谱流出物，均匀地滴加在移动带上，蒸发、除去溶剂后，待测化合物被引入质谱离子源。移动带接口不适宜于极性大或热不稳定化合物的分析，测得的质谱可以由电子轰击离子化或化学离子化或快原子轰击离子化产生。
（3）大气压离子化接口是目前液相色谱-质谱联用广泛采用的接口技术。由于兼具离子化功能，这些接口将在离子源部分介绍。
4.超临界流体色谱-质谱联用（SFC-MS）
超临界流体色谱-质谱联用主要采用大气压化学离子化或电喷雾离子化接口。色谱流出物通过一个位于柱子和离子源之间的加热限流器转变为气态，进入质谱仪分析。
5.毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）
几乎所有的毛细管电泳操作模式均可与质谱联用。选择接口时，应注意毛细管电泳的低流速特点并使用挥发性缓冲液。电喷雾离子化是毛细管电泳与质谱联用最常用的接口技术。
二、离子源
根据待测化合物的性质及拟获取的信息类型，可以选用不同的离子源。
1.电子轰击离子化（EI）
处于离子源的气态待测化合物分子，受到一束能量（通常是70eV）大于其电离能的电子轰击而离子化。质谱中往往含有待测化合物的分子离子及具有待测化合物结构特征的碎片离子。电子轰击离子化适用于热稳定的、易挥发化合物的离子化，是气相色谱-质谱联用最常用的离子化方式。当采用粒子束或移动带等接口时，电子轰击离子化也可用于液相色谱-质谱联用。
2.化学离子化（CI）
离子源中的试剂气分子（如甲烷、异丁烷和氨气）受高能电子轰击而离子化，进一步发生离子一分子反应，产生稳定的试剂气离子，再使待测化合物离子化。化学离子化可产生待测化合物（M）的（M+H）⁺或（M-H）^-特征离子、或待测化合物与试剂气分子产生的加合离子。与电子轰击离子化质谱相比，化学离子化质谱中碎片离子较少，适宜于采用电子轰击离子化无法得到分子质量信息的热稳定的、易挥发化合物分析。
3.快原子轰击（FAB）或快离子轰击离子化（LSIMS）
高能中性原子（如氩气）或高能铯离子，使置于金属表面、分散于惰性黏稠基质（如甘油）中的待测化合物离子化，产生（M+H）⁺或（M-H）^-特征离子或待测化合物与基质分子的加合离子。快原子轰击或快离子轰击离子化非常适合于各种极性的、热不稳定化合物的分子质量测定及结构表征，广泛应用于分子质量高达10000道尔顿的肽、抗生素、核苷酸、脂质、有机金属化合物及表面活性剂的分析。
快原子轰击或快离子轰击离子化用于液相色谱-质谱联用时，需在色谱流动相中添加1%～10%的甘油，且必须保持很低流速（1～10μl/min）。
4.基质辅助激光解吸离子化（MALDI）
将溶于适当基质中的供试品涂布于金属靶上，用高强度的紫外或红外脉冲激光照射，使待测化合物离子化。基质辅助激光解吸离子化主要用于分子质量在100000道尔顿以上的生物大分子分析，适宜与飞行时间分析器结合使用。
5.电喷雾离子化（ESI）
离子化在大气压下进行。待测溶液（如液相色谱流出物）通过一终端加有几千伏高压的毛细管进入离子源，气体辅助雾化，产生的微小液滴去溶剂，形成单电荷或多电荷的气态离子。这些离子再经逐步减压区域，从大气压状态传送到质谱仪的高真空中。电喷雾离子化可在1μl/min～1ml/min流速下进行，适合极性化合物和分子质量高达100000道尔顿的生物大分子研究，是液相色谱-质谱联用、毛细管电泳-质谱联用最成功的接口技术。
6.大气压化学离子化（APCI）
原理与化学离子化相同，但离子化在大气压下进行。流动相在热及氮气流的作用下雾化成气态，经由带有几千伏高压的放电电极时离子化，产生的试剂气离子与待测化合物分子发生离子-分子反应，形成单电荷离子，正离子通常是（M+H）⁺，负离子则是（M-H）^-。大气压化学离子化能在流速高达2ml/min下进行，常用于分析分子质量小于1500道尔顿的小分子或弱极性化合物，主要产生的是（M+H）⁺或（M-H）^-离子，很少有碎片离子，是液相色谱-质谱联用的重要接口之一。
7.大气压光离子化（APPI）
与大气压化学离子化不同，大气压光离子化是利用光子使气相分子离子化。该离子化源主要用于非极性物质的分析，是电喷雾离子化、大气压化学离子化的一种补充。大气压光离子化对于试验条件比较敏感，掺杂剂、溶剂及缓冲溶液的组成等均会对测定的选择性、灵敏度产生较大影响。
三、质量分析器
质量范围、分辨率是质量分析器的两个主要性能指标。质量范围指质量分析器所能测定的质荷比的范围；分辨率表示质量分析器分辨相邻的、质量差异很小的峰的能力。虽然不同类型的质量分析器对分辨率的具体定义存在差异，高分辨质谱仪通常指其质量分析器的分辨率大10⁴。
1.扇形磁场分析器
离子源中产生的离子经加速电压（V）加速，聚焦进入扇形磁场（磁场强度B）。在磁场的作用下，不同质荷比的离子发生偏转，按各自的曲率半径（r）运动：m/z = B²r²/2V
改变磁场强度，可以使不同质荷比的离子具有相同的运动曲率半径（r），进而通过狭缝出口，达到检测器。
扇形磁场分析器可以检测分子质量高达15000道尔顿的单电荷离子。当与静电场分析器结合、构成双聚焦扇形磁场分析器时，分辨率可达到10⁵。
2.四极杆分析器
分析器由四根平行排列的金属杆状电极组成。直流电压（DC）和射频电压（RF）作用于电极上，形成了高频振荡电场（四极场）。在特定的直流电压和射频电压条件下，一定质荷比的离子可以稳定地穿过四极场，到达检测器。改变直流电压和射频电压大小，但维持它们的比值恒定，可以实现质谱扫描。
四极杆分析器可检测的分子质量上限通常是4000道尔顿，分辨率约为10³。
3.离子阱分析器
四极离子阱（QIT）由两个端盖电极和位于它们之间的环电极组成。端盖电极处在地电位，而环电极上施加射频电压（RF），以形成三维四极场。选择适当的射频电压，四极场可以储存质荷比大于某特定值的所有离子。采用“质量选择不稳定性”模式，提高射频电压值，可以将离子按质量从高到低依次射出离子阱。挥发性待测化合物的离子化和质量分析可以在同一四极场内完成。通过设定时间序列，单个四极离子阱可以实现多级质谱（MSⁿ）的功能。
线性离子阱（LIT）是二维四极离子阱，结构上等同于四极质量分析器，但操作模式与三维离子阱相似。四极线性离子阱具有更好的离子储存效率和储存容量，可改善的离子喷射效率及更快的扫描速度和较高的检测灵敏度。
离子阱分析器与四极杆分析器具有相近的质量上限及分辨率。
4.飞行时间分析器（to F）
具有相同动能、不同质量的离子，因飞行速度不同而实现分离。当飞行距离一定时，离子飞行需要的时间与质荷比的平方根成正比，质量小的离子在较短时间到达检测器。为了测定飞行时间，将离子以不连续的组引入质量分析器，以明确起始飞行时间。离子组可以由脉冲式离子化（如基质辅助激光解吸离子化）产生，也可通过门控系统将连续产生的离子流在给定时间引入飞行管。
飞行时间分析器的质量分析上限约15000道尔顿、离子传输效率高（尤其是谱图获取速度快）、质量分辨率>10⁴。
5.离子回旋共振分析器（ICR）
在高真空（～10⁷Pa）状态下，离子在超导磁场中作回旋运动，运行轨道随着共振交变电场而改变。当交变电场的频率和离子回旋频率相同时，离子被稳定加速，轨道半径越来越大，动能不断增加。关闭交变电场，轨道上的离子在电极上产生交变的像电流。利用计算机进行傅立叶变换，将像电流信号转换为频谱信号，获得质谱。
待测化合物的离子化和质量分析可以在同一分析器内完成。离子回旋共振分析器的质量分析上限>10⁴道尔顿，分辨率高达10⁶，质荷比测定精确到千分之一，可以进行多级质谱（MSⁿ）分析。
6.串联质谱（MS-MS）
串联质谱是时间上或空间上两级以上质量分析的结合，测定第一级质量分析器中的前体离子（precursor ion）与第二级质量分析器中的产物离子（product ion）之间的质量关系。 多级质谱实验常以MSⁿ表示。
产物离子扫描（product-ion scan） 在第一级质量分析器中选择某m/z的离子作为前体离子，测定该离子在第二级质量分析器中、一定的质量范围内的所有碎片离子（产物离子）的质荷比与相对强度，获得该前体离子的质谱。
前体离子扫描（precursor-ion scan） 在第二级质量分析器中选择某m/z的产物离子，测定在第一级质量分析器中、一定的质量范围内所有能产生该碎片离子的前体离子。
中性丢失扫描（neutral-loss scan） 以恒定的质量差异，在一定的质量范围内同时测定第一级、第二级质量分析器中的所有前体离子和产物离子，以发现能产生特定中性碎片（如CO₂）丢失的化合物或同系物。
选择反应检测（selected-reaction monito ring，SRM） 选择第一级质量分析器中某前体离子（m/z）₁，测定该离子在第二级质量分析器中的特定产物离子（m/z）₂的强度，以定量分析复杂混合物中的低浓度待测化合物。
多反应检测（multiple-reaction monito ring，MRM） 是指同时检测两对及以上的前体离子一产物离子。
四、测定法
在进行供试品分析前，应对测定用单级质谱仪或串联质谱仪进行质量校正。可采用参比物质单独校正或与被测物混合测定校正的方式。
1.定性分析
以质荷比为横坐标，以离子的相对丰度为纵坐标，测定物质的质谱。高分辨质谱仪可以测定物质的准确分子质量。
在相同的仪器及分析条件下，直接进样或流动注射进样，分别测定对照品和供试品的质谱，观察特定m/z处离子的存在，可以鉴别药物、杂质或非法添加物。产物离子扫描可以用于极性的大分子化合物的鉴别。复杂供试品中待测成分的鉴定，应采用色谱-质谱联用仪或串联质谱仪。
质谱中不同质荷比离子的存在及其强度信息反映了待测化合物的结构特征，结合串联质谱分析结果，可以推测或确证待测化合物的分子结构。当采用电子轰击离子化时，可以通过比对待测化合物的质谱与标准谱库谱图的一致性，快速鉴定化合物。未知化合物的结构解析，常常需要综合应用各种质谱技术并结合供试品的来源，必要时还应结合元素分析、光谱分析（如核磁共振、红外光谱、紫外光谱、X射线衍射）的结果综合判断。
2.定量分析
采用选择离子检测（selected-ion monito ring，SIM）或选择反应检测或多反应检测，外标法或内标法定量。内标化合物可以是待测化合物的结构类似物或其稳定同位素（如2H，13C，15N）标记物。
分别配制一定浓度的供试品及杂质对照品溶液，色谱-质谱分析。若供试品溶液在特征m/z离子处的响应值（或响应值之和）小于杂质对照品溶液在相同特征m/z离子处的响应值（或响应值之和），则供试品所含杂质符合要求。
复杂样本中的有毒有害物质、非法添加物、微量药物及其代谢物的色谱-质谱分析，宜采用标准曲线法。通过测定相同体积的系列标准溶液在特征m/z离子处的响应值，获得标准曲线及回归方程。按规定制备供试品溶液，测定其在特征m/z离子处的响应值，带入标准曲线或回归方程计算，得到待测物的浓度。内标校正的标准曲线法是将等量的内标加入系列标准溶液中，测定待测物与内标物在各自特征m/z离子处的响应值，以响应值的比值为纵坐标，待测物浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。使用稳定同位素标记物作为内标时，可以获取更好的分析精密度和准确度。