乳酶生片

乳酶生片

Rumeisheng Pian Lactasin Tablets

本品按标亦量计算，每1g含活肠链球菌（Stre pto cocus faecalis）不得少于300万个。

【性状】本品为白色或类白色片。

【鉴别】照乳酶生项下的鉴别试验，显相同结果。

其他应符合片剂项下有关的各项规定（附录5页）。

【含量测定】取本品20片（0.5g规格）10片（1g规格），置盛有玻璃珠及100ml氯化钠注射

液的锥形瓶中，振摇，制成混悬液。照乳酸菌制剂检验法项下的活乳酸菌菌数测定法测定，即得。

【作用与用途】同乳酶生。

【用法与用量】内服一次量羊、猪2~10g驹、犊10~30g

【规格】（1）0.1g （2）0.5g （3）1g

【贮藏】遮光，密封，在凉暗处保存。

乳酸菌制剂检验法

本试验法包括牛奶凝固力、乳酸鉴别法、活乳酸菌数测定及乳酸菌鉴别法。

一、牛奶凝固力及乳酸鉴别法

 牛奶培养基的制备取新鲜牛奶（附注1），用蒸汽加热20分钟或置沸水浴中煮30分钟后，于冷处放置18小时以上，使乳脂析出，然后用虹吸管吸出脱脂牛奶，分装于试管中，每管20ml，用115.5℃蒸汽灭菌20分钟。

 试验法（1）牛奶凝固力取供试品0.1~0.3g，加至20ml牛奶培养基中，摇匀；在37℃培养48小时，同时做两管，作为供试品管，以牛奶培养基为对照管，供试品管的牛奶应呈正常凝固现象（表面无多量乳清分出，凝块均匀稠密结实，无气体产生，无消化现象）。

（2）乳酸鉴别取上述供试品管和对照管的培养液各1ml，分别注人两支试管（15mm×160mm）中，各加硫酸溶液 （1—10）3~5滴，振摇，加乙醚约10ml，强烈振摇，放置数分钟。分别将上层乙醚液倒入两支试管（16mm×180mm） 中，并于热水浴中除去乙醚。残留物中各加水2ml，摇匀，分别吸取0.2ml，置另两支试管中，各加硫酸2ml，摇勻，置水浴中加热2分钟，取出，立即用冷水冷却，分别滴入10%愈刨木酚的乙醇溶液1滴，振摇后，对照管显橙色。供试品管应显红色。

结果的判断（1）乳酸鉴别试验呈正反应，牛奶呈正常凝固现象，供试品判定为合格。

乳酸鉴别试验呈正反应，牛奶呈不均匀的粉碎的凝块，并分出大量乳清，凝块有气泡及消化现象，表示有杂菌生长，但供试品仍可判合格。

乳酸鉴别试验呈负反应，牛奶呈不正常凝固或者不凝固，表示乳酸菌极少或者无乳酸菌生长，而仅是杂菌生长，供试品不合格。

二、活乳酸菌菌数测定法

培养基的制备

含糖牛肉汤培养基

牛肉浸液（附注2）   1000ml

氯化钠5g

胨
  10g

乳糖     20g

将氯化钠、胨、乳糖加人牛肉浸液中，置水浴上加热，搅拌，使完全溶解，放冷至室温，调节pH值使灭菌后为6.0,分装，115.5℃灭菌20分钟。

含糖牛肉汤琼脂培养基照含糖牛肉汤培养基的处方，加琼脂使每100ml中含琼脂1.5~2g，在水浴上加热使溶解，分装，115.5℃灭菌20分钟。

20%碳酸钙混悬液取极细的结晶性碳酸钙粉末，加水制成20%的混悬液，121.5℃灭菌20分钟。

测定法（1）供试品稀释液的制备无菌操作。从两个包装的供试品中，称取10g，加人灭菌生理盐水100ml， 振摇均匀，制成混悬液，用1ml的灭菌吸管稀释成1:100, 1 :1000, 1 : 10000, 1 : 100000, 1 : 1000000等各种稀释度的混悬液，每一稀释度吹洗3次，并更换吸管。

（2）接种与培养分别用灭菌吸管吸取每种稀释度的混悬液1ml，吹人灭菌平皿中，每份同法接种2个平皿。

将20%碳酸钙混悬液置水浴中加温后，摇勻，趁热用灭菌吸管吸取5ml，加至已融化约100ml含糖牛肉汤琼J3旨培养基中，摇匀，放冷至45~55℃，取10~15ml,加至上述已接种供试品稀释液的平皿中，随即转动平皿，使充分混合，待琼脂凝固后，翻转平板，在37℃培养72小时，观察结果。有透明圈的菌落即为乳酸菌。

菌落计算选取菌落分布均匀、菌落数为30~300个的平皿，点数菌落数（附注3）。求得两个平皿的平均菌落数（若两个平皿的菌落数相差1倍以上，需重新试验），再乘以供试品的稀释倍数，即为每1g乳酸菌制剂所含活菌数。

三、杂菌数检查法

培养基的制备普通肉汤琼脂培养基（附录138页）

检查法（1）供试品稀释液的制备同活乳酸菌菌数测定法。

接种与培养分别无菌吸取每种稀释度的混悬液1ml，于灭菌平皿中，每份同法接种两个平皿，及时将融化并放冷至45~50℃的普通肉汤琼脂培养基倾注平皿内，置37℃培养48小时，观察结果。

菌落计算选取菌落数为30~300个的平皿，点数菌落数（附注3），求得两个平皿的平均菌落数（若两个平皿的菌落数相差1倍以上，需重新试验），乘以供试品的稀释倍数，即得每1g乳酸菌制剂所含的杂菌数。

四、霉菌数检查法

1.虎红琼脂培养基制备

胨	5g
葡萄糖	10g
磷酸二氢钾	1g
硫酸镁（MgSO 7H20）	0.5g
琼脂	15~20g
4/3000虎红（四氯四碘荧光素）溶液	100ml
水	900ml

除琼脂、葡萄糖和虎红溶液外，混合上述成分，加入琼脂，加热使融化，滤过加葡萄糖溶解后，摇匀，加人虎红溶液，115℃灭菌30分钟。

2.检查法（1）供试品稀释液的制备照活乳酸菌菌数测定法项下的方法，稀释成1:100, 1:1000两个稀释度的混合液。

接种与培养分别无菌吸取每种稀释度的混悬液1ml，吹人灭菌平皿中，每份同法接种两个平皿，及时将融化并冷至45~50℃的虎红琼脂培养基倾入平皿内，各约15ml，充分摇匀，待琼脂凝固后。翻转平皿，置25~28℃，培养72小时。

菌落计算选取菌落数5~50的平皿，点数霉菌菌落数，求得两个平皿的平均菌落数，乘以供试品的稀释倍数，即得每1g乳酸菌制剂所含的霉菌数。

五、肠道致病菌检查法
i.苯胺蓝琼脂培养基的制备
普通肉汤琼脂培养基	100ml
（同杂菌数检查法项下pH7. 4）
乳糖	1g
0.5%苯胺蓝溶液	1ml
1%玫红酸乙醇溶液	1ml
取乳糖，加人灭菌普通肉汤琼脂培养基中，115℃加热15分钟，使融化，放冷至50℃后，按无菌操作，加人已灭

菌的苯胺蓝溶液1ml、玫红酸乙醇溶液1ml，摇勻后，备用。

2.检查法自1:10的试品稀释液中取1ml，置无菌平皿中，加已融化的苯胺蓝琼脂培养基10~15ml，摇匀，冷凝后，在37℃培养48小时，如无菌落生长，或生长菌落均呈蓝色时，判肠道致病菌为阴性。

六、乳酸菌鉴别法

运动性检查（1）培养基用活乳酸菌测定法项下含糖牛肉汤培养基。

（2）鉴别法自活乳酸菌计数的平皿中，选出具有透明圈的各种不同形态的菌落，每种选取两个菌落，分别种入含糖牛肉汤培养基中，在37℃培养24小时后，应生长发育良好，取菌液，以悬滴检查法观察，应无运动性。

石蕊牛奶凝固试验（1）石蕊牛奶培养基的制备取牛奶培养基，每100ml中加石蕊乙醇溶液（附注4）2.5ml，混勻，取5~10ml分装于试管中，115.5℃灭菌20分钟。

（2）试验法自上述含糖牛肉汤培养液中，取1自金耳菌液，种入5~10ml的石蕊牛奶培养基中，在37℃：培养48小时，石蕊应还原为无色，牛奶应呈正常凝固现象，培养基上层表面应呈紫红色环。

显微镜检查自上项含糖牛肉汤培养液中取菌液涂片，革兰染色后，于油镜下检查，记录其形态和革兰染色的颜色。

酸度测定及乳酸鉴别试验自上项含糖牛肉汤培养液中取1白金耳菌液，种人牛奶培养基20ml中，另取对照用牛奶培养基20ml，同时在37℃培养48小时后，分别进行酸度测定（附注1），并按牛奶凝固力及乳酸鉴别法项下的方法进行乳酸鉴别试验。

接触酶试验自上述含糖牛肉汤培养液中，取1白金耳菌液，种于含糖牛肉汤琼脂斜面上，在37℃培养48小时后，将3%过氧化氢溶液滴加于生长的菌落表面上，观察有无气泡产生，有气泡则为阳性反应，反之则为阴性反应。

[附注]

 新鲜牛奶取相对密度在1.028以上的牛奶5ml与水20ml，置锥形瓶中。加酚酞指示液3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定至淡红色在1分钟内不完全消失为止。一般新鲜牛奶所消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）不得 过1.0ml（本法亦供乳酸菌于牛奶培养基中生长后的酸度测定）。

牛肉浸液取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后，每1000g加水3000ml，充分拌匀，在2~10℃浸泡 20~24小时后，煮沸1小时，滤过，压干肉渣，补足液量，分装，121℃灭菌30分钟，置冷暗处备用。也可用牛肉浸膏3g，加水1000ml，配成溶液代替。

杂菌计数如果在较小稀释度培养基中所生长的菌落数量较多，菌落形态相似，呈极小点状或梭状，或在较 大稀释度培养基中菌落形态相似时，可能为乳酸菌生长：照乳酸菌鉴别法项下的悬滴检查法或石蕊牛奶凝固试验法鉴别，如为乳酸菌，应不计算在内。

石蕊乙醇溶液取石蕊20g，研磨后置锥形瓶中，加人40%乙醇150ml，煮沸1分钟，倾出上层液；再加人40%乙醇150ml，煮沸1分钟，倾出上层液，合并上层液；再以40%乙醇加至全量为300ml，滴加lmol/L盐酸溶液，随加随振摇，至溶液变紫色为止。pH值应为6.0~8.0。