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3125 组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺测定法

本法系依据磷酸组胺与邻苯二甲醛在碱性条件下生成荧光衍生物,以此测定组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺含量。
磷酸组胺对照品溶液的制备 取磷酸组胺对照品7mg,精密称定,置25ml量瓶中,用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,作为磷酸组胺贮备液,-20℃贮存备用。试验当天准确量取磷酸组胺贮备液0.1ml,置100ml量瓶中,用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度,即为磷酸组胺对照品溶液。
供试品溶液的制备 量取供试品0.5ml,加水1.2ml,混匀,加25%三氯乙酸溶液0.3ml,混匀,以每分钟4000转离心10分钟,取上清液,即为供试品溶液。
测定法 量取供试品溶液1.6ml置试管中,加氯化钠1.5g,再加正丁醇4.0ml、2.5mol/L氢氧化钠溶液0.2ml,立即混匀5分钟,静置后,取出正丁醇相3.6ml加到已装有0.1mol/L盐酸溶液1.2ml和正庚烷2.0ml的试管内,振荡5分钟,弃有机相,量取盐酸相1.0ml,加入等体积水,再加0.4mol/L氢氧化钠溶液0.5ml,混匀并迅速加入0.1%邻苯二甲醛-甲醇溶液0.1ml,立即混匀,置 21~22℃10分钟,加0.5mol/L盐酸溶液0.5ml终止反应,取终止反应后的溶液200μl,加入酶标板孔中,用荧光酶标仪,在激发波长350nm和发射波长450nm处测荧光强度。
准确量取磷酸组胺对照品溶液1.0ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0.1ml、0.05ml、0.025ml,分别置试管中,各以0.1mol/L盐酸溶液补足至1.0ml;向各管中加水0.5ml、25%三氯乙酸溶液0.1ml,混匀,加氯化钠1.5g,自“再加正丁醇4.0ml”起,同法操作。
以磷酸组胺对照品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归,将供试品溶液的荧光强度代入直线回归方程,求出供试品溶液碱基含量(G),按下式计算:
供试品游离磷酸组胺含量(ng/ml)=G×2.76×2.5
【附注】磷酸组胺分子量为307.148,对照品溶液浓度按碱基计,碱基与磷酸组胺分子量比为1:2.76。式中2.5为供试品稀释倍数。
关键字:3125 组胺
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