猪支原体肺炎灭活疫苗（P-5722-3株）

本品系用猪肺炎支原体P-5722-3株（NL1042株）接种适宜培养基培养，收获培养物，经BEI灭活后，与矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防猪支原体肺炎。
【处方】
【制法】
【性状】乳白色乳剂。
【鉴别】
【检查】
【含量测定】
【作用与用途】
【用法与用量】
【注意事项】
【规格】（1）50头份（100ml）/瓶（2）250头份（500ml）/瓶（3）500头份（1000ml）/瓶
【贮藏】2～8℃保存，有效期为24个月。
【制剂】
附注：猪支原体肺炎灭活疫苗效力检验方法采用固相ELISA法测定疫苗中所含抗原的相对效力单位。
1材料1.1设备1.1.196孔微量反应板1.1.2酶联读数仪1.1.3超声波裂解器1.1.4离心机1.1.51489mm离心管1.1.62589mm离心管1.1.7加样器及配套吸头1.1.8酶联洗板机1.1.9温箱1.1.10pH计1.1.11混合器1.1.12试剂贮存管1.1.13微量板震荡器1.1.14RELPOT软件包（3.1或更新版本）1.1.15吸水纸1.2缓冲液1.2.10.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）氯化钠8.0g氯化钾0.2g磷酸二氢钾0.2g磷酸氢二钠1.15g纯水加至1L将各种盐按比例溶解于水中，调至pH7.20.1。在室温下保存，如不打开，可使用6个月，打开后，可使用3个月。1.2.2PBS-吐温20（PBST）取0.5ml吐温20，加到1LPBS中。在室温下保存，如不打开，可使用6个月，打开后，可使用3个月。1.2.31%PVA/PBS取10g聚乙烯醇（PVA，88%水解物），加到1LPBS中，稍加热，使其溶解。滤过。在室温下保存，可使用3个月。1.3试剂1.3.1猪肺炎支原体单克隆抗体Norden杂交瘤1-2’腹水单抗。在-10～-25℃下保存。经WesternBlot试验证实，该单抗识别猪肺炎支原体上的40kD蛋白质。1.3.2参考疫苗1.3.3阴性对照品含5%Amphigen的生理盐水乳剂。在-65℃下保存。1.3.4阳性对照品1.3.5酶结合物通过亲和层析方法纯化的羊抗鼠IgG（H L）过氧化物酶结合物，每瓶1.0mg。冻干的酶结合物在2～8℃下保存，使用时，用1%PVA/PBS稀释至终浓度为0.5mg/ml。稀释后的酶结合物在-10～-25℃下可保存1年。1.3.6底物ABTS。2待检疫苗、参考疫苗、阳性对照品、阴性对照品的处理2.1将各种样品（待检疫苗、参考疫苗、阳性对照品和阴性对照品）至少14ml在65℃以下冷冻至少24小时。2.2将待检疫苗、参考疫苗、阳性对照品和阴性对照品在372℃下融化20分钟。2.3将上述样品分别分成2等份（各7ml），分别加入离心管中，超声处理55～65秒（脉冲，50%功率循环，输出功率=4），并用循环水进行冷却。2.4将上述每种超声处理过的样品混合，分别倒入超速离心管中（每种样品约12.0～12.5ml），在2～8℃下以30000r/min离心6小时。2.5离心后，小心弃去油层和上清液，用Kimwipe对离心管进行干燥，直到除去离心管内壁上残留的油层。分别将待检疫苗、参考疫苗、阳性对照品和阴性对照品的离心沉淀物溶解在1.2mlPBS中，用封口膜封口，置2～8℃过夜。2.6次日，通过振动和反复吹吸使猪肺炎支原体细胞沉淀物充分溶解。3抗原包被3.1抗原稀释3.1.1参考疫苗抗原进行2倍系列稀释，直至1:128。3.1.2待检疫苗抗原和阳性对照品稀释到参考疫苗工作曲线范围内。3.1.3阴性对照品稀释至1:16（取62.5ul阴性对照品样品加到937.5ulPBS中）。3.1.4空白对照PBS。3.2包被取一96孔板，每份抗原一式3孔，每孔加100ul。加盖，置372℃60～65分钟。用PBS手动洗涤一次。4封闭每孔中各加入1%PVA/PBS250ul，加盖，置372℃30～35分钟，倒去液体，拍干。5加入指示抗体用1%PVA/PBS将腹水单抗稀释成1:1000，每孔加100ul，加盖，置372℃60～65分钟。用PBST洗板3次。6加入酶标抗体用1%PVA/PBS将羊抗鼠IgG（H L）过氧化物酶结合物稀释成1:4500，每孔加入刚稀释好的酶标抗体溶液100ul，加盖，置372℃60～65分钟。用PBST洗板3次。7加入底物每孔中加入新制备的ABTS100ul，加盖，置室温下30分钟。振荡反应板后，在酶联读数仪上读取波长405nm下的OD值。8数据处理用RELPOT软件包（3.1或更新版本）进行数据处理。8.1将"最小OD值"设置为0.05，将"最小斜度"设置为0.15，将超出这些范围的数据自动剔除。8.2将每孔OD值减去空白孔OD值的平均值。8.3输入参考疫苗校正后的OD值和稀释度。8.4输入阳性对照品和待检疫苗校正后的OD值和稀释度。8.5将输入的数据进行处理，并打印结果。8.6根据打印结果中的最高数值选择阳性对照品和待检疫苗的最高RP值。9结果判定每批疫苗出厂时的RP值应不低于6.33，在整个有效期内的RP值应不低于5.06。9.1"无结果"是指：缺乏有效的参考疫苗或其他样品的线（在有效的参考疫苗或样品线中，每个参考疫苗应至少有3个点，每个阳性对照品或待检疫苗应至少有3个点）；阴性对照品的OD值大于参考疫苗的最小OD值；根据有效的平行线得到的对照样品的效力，超出了2个标准差范围。如发生上述情况，可以重检至多2次。如在某批产品的检验过程中，由于相同原因出现3次"无结果"，则应停止对该批疫苗的检验，直到查清原因并使问题得到解决为止。在问题得到解决后，可对该批产品进行重检。9.2"结果可疑"是指：可以获得有效的参考疫苗线和待检疫苗线，但二者不平行。由于不能确定产品的效力是否合格，因此该批产品不能出厂。如果第1次检验结果为"结果可疑"，可以重检3次。根据表1中的重检情况确定产品的效力检验结果。若不重检，则判该批疫苗不合格。9.3"不合格"是指：在第1次检验中产生了有效的平行线，但疫苗效力低于最低标准。至少应进行2次重检，但不超过3次。根据表2中的重检情况确定产品的效力检验结果。若不重检，则判该批疫苗不合格。