3512 狂犬病免疫球蛋白效价测定法

3512 狂犬病免疫球蛋白效价测定法
第一法小鼠中和试验法（仲裁法）
本法系依据供试品中狂犬病免疫球蛋白能中和狂犬病病毒的作用，将供试品和标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液混合，小鼠脑内注射，在规定时间内观察小鼠存活和死亡情况，以测定供试品效价。
试剂 （1）磷酸盐缓冲液（PBS） 称取磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄?12H₂O）1.44g、氯化钠8.0g，加水溶解并稀释至1000ml，用氢氧化钠调pH值至7.2~8.0。
（2）2%新生牛血清磷酸盐缓冲液 量取PBS 98ml，加入2ml灭能新生牛血清。临用前配制。
（3）20%新生牛血清磷酸盐缓冲液 量取PBS80ml，加入20ml灭能新生牛血清。临用前配制。
中和用病毒悬液的制备 （1）病毒悬液的制备 取CVS毒种（一般为冻干毒种）制成10^-2悬液，制法见本法（2）项，脑内接种体重10~12g小鼠每只0.03ml，待发病后取鼠脑再制成10^-2悬液，接种于小鼠脑内进行传代，一般传2~3代。选用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿，冻干后真空封口，制成冻干中和用病毒，-30℃冻存待用；或用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%新生牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10^-1悬液，以每分钟2000转离心20分钟，取上清液混匀后分装小管，-70℃冻存待用。
（2）病毒悬液毒力的预测 ①冻干病毒的预测 取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入2%新生牛血清磷酸盐缓冲液1.0ml，吹打均匀后加入4.0ml 2%新生牛血清磷酸盐缓冲液与病毒液充分混匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液与等量的2%新生牛血清磷酸盐缓冲液混合即为10^-2悬液，然后再稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，从10^-6~10^-2的稀释液中各取0.5ml置5个小管内，每管再加入2%新生牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴1小时。用体重10~12g小鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10^-6~10^-2病毒悬液接种小鼠，每个稀释度接种6只小鼠，每只小鼠脑内接种0.03ml，每天观察小鼠发病死亡情况，观察14天，接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小鼠统计LD₅₀。
②-70℃冻存病毒的预测 取含10%脑悬液的冰冻病毒，融化后即为10^-1悬液，然后再稀释至10^-2~10^-7。从10^-7~10^-3各取0.5ml加至5个小管内，每管再加入2%新生牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴1小时。用体重10~12g小鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10^-7~10^-3病毒悬液接种小鼠，每个稀释度接种小鼠6只，每只小鼠脑内接种0.03ml，每天观察小鼠发病死亡情况，观察14天。接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小鼠统计LD₅₀。
（3）中和用病毒悬液的制备 按病毒悬液预测的100LD₅₀的病毒稀释度作为中和用病毒悬液稀释倍数，用于小鼠中和试验。要求中和用病毒悬液经37℃水浴作用1小时的病毒量在32~320LD₅₀之间。
狂犬病免疫球蛋白标准品溶液的制备 配制方法按使用说明书进行。
供试品溶液的制备 用2%新生牛血清磷酸盐缓冲液将供试品做2倍稀释，一般可采用1：800、1：1600、…、1：102400，但可根据供试品实际效价适当降低或提高最低稀释倍数，如采用上述8个稀释倍数，则按稀释液2.7ml加入供试品0.3ml作为1：10供试品溶液，然后再用稀释液3.5ml加入混匀的1：10的供试品溶液0.5ml作为1：80供试品溶液，再按稀释液2.7ml加入1：80的供试品溶液0.3ml作为1：800供试品溶液（1）。再按0.5ml加0.5ml做倍比稀释制备供试品溶液（2）~（8），它们的稀释倍数依次为1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200和1：102400。
测定法 取8个稀释度的供试品溶液（1）~（8）各0.5ml置8支小试管中，另取8个稀释度的标准品溶液各0.5ml置8支小试管中，共16支小试管，分别加入中和用病毒悬液0.5ml，置37℃水浴1小时，供注射小鼠用。另用相同体重的小鼠测定中和用病毒悬液的实际LD₅₀，其方法可将中和用病毒悬液作为原倍再稀释10⁰、10^-1、10^-2、10^-3共4个稀释度，以上4个稀释度各加入0.5ml于小管内，每管再加入2%新生牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，同样置37℃水浴1小时作为中和病毒对照。将已中和的供试品和标准品的不同稀释度的悬液以及病毒对照分别接种小鼠，供试品和标准品按从浓到稀的稀释度接种小鼠，而病毒对照则按从稀到浓的稀释度接种小鼠。小鼠体重10~12g，每只小鼠脑内接种0.03ml。每稀释度注射6只小鼠。每天记录小鼠的发病死亡情况，共观察14天，接种后4天内死亡的小鼠作为非特异性死亡计。


第二法 快速荧光灶抑制试验法
本法系依据供试品中狂犬病免疫球蛋白能中和狂犬病病毒的作用，将供试品和标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液混合，感染敏感细胞，在规定的时间内用荧光抗体染色并观察荧光灶减少的情况，以测定供试品效价。
试剂 （1）含5%新生牛血清的DMEM细胞培养基 取含5%新生牛血清的DMEM细胞培养基，加入抗生素，使其终浓度为100U/ml抗生素，并加入谷氨酰胺，使其终浓度为0.03%，临用前配制并按DMEM说明书要求加入适量NaHCO₃调pH值至7.6。
（2）含10%新生牛血清的DMEM细胞培养基 取含10%新生牛血清的DMEM细胞培养基，加入抗生素，使其终浓度为100U/ml抗生素，并加入谷氨酰胺，使其终浓度为0.03%，临用前配制并按DMEM说明书要求加入适量NaHCO₃调pH值至7.6。
（3）磷酸盐缓冲液（PBS） 称取磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄.12H₂O）1.44g、氯化钠8g，加水溶解并稀释至1000ml，用氢氧化钠调pH值至7.2。临用前配制。
（4）80%冷丙酮 量取80ml丙酮，加入0.1mol/L PBS（pH7.6）20ml，混匀后密封，于4℃保存。
（5）80%甘油 量取80ml甘油，加入20ml水中，混匀，加盖后于保存。
（6）0.25%胰蛋白酶-EDTA。
（7）FITC标记的狂犬病病毒核蛋白抗体 按使用说明书要求稀释到工作浓度。
中和用病毒的制备 （1）病毒悬液的制备 取CVS-11毒种（一般为冻干毒种）做适当稀释，以0.1MOI的感染量接种生长良好的BSR细胞，于37℃、5%二氧化碳条件下培养1天后转入34℃继续培养，2天后收集培养上清液，于4℃以每分钟4000转离心10分钟去除细胞碎片，取上清液加入10%新生牛血清，混匀后分装小管，-70℃以下冻存备用。
病毒液的预滴定：取冻存的病毒悬液1支，经流水速融后，在24孔培养板上从1：5开始做5倍系列稀释，取100μl病毒液加入400μl含10%灭能新生牛血清的DMEM培养液中，充分混匀后，每个稀释度取50μL转移至96孔培养板，每个稀释度平行做2份，每孔再加入5×10⁶/ml的BSR细胞悬液50μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。培养结束后弃上清液，PBS洗1遍，再加入80%冷丙酮，每孔50μl，4℃固定30分钟，或-30℃固定10分钟，弃丙酮，待挥发干燥后每孔加入50μl工作浓度的FITC标记的狂犬病病毒核蛋白抗体染色，于37℃孵育30分钟，用PBS洗3遍，甩干，每孔加80%甘油50μl，于荧光显微镜下观察；计数每孔中的荧光灶数，取每孔荧光灶数在30以下的孔，记录相邻4孔荧光灶数，取其平均值，计算如下：

（2）中和用病毒液的制备 取病毒悬液1支，按病毒液的预滴定同法操作。在荧光显微镜下计数每孔中的荧光灶比例，以80%~95%的细胞被病毒感染的病毒稀释度为中和试验用病毒稀释度。
取冻存的病毒悬液1支，经流水融化后，用含5%灭能新生牛血清的DMEM培养液将病毒稀释至中和试验用病毒稀释度，置冰浴备用。
狂犬病免疫球蛋白标准品溶液的制备 狂犬病免疫球蛋白标准品由国家药品检定机构提供，或用经国家药品检定机构标定的工作用标准品。配制方法按使用说明书进行。用含10%灭能新生牛血清的DMEM培养液将狂犬病免疫球蛋白标准品做3倍系列稀释，即在96孔培养板中每孔预先加入100μl培养液，取50μl供试品加入其中，成为1：3稀释度，充分混合后，吸取50μl加入下一孔100μl培养液中，成为1：9稀释度，如此系列稀释若干孔至适宜稀释度。
供试品溶液的制备 供试品（血清样品应预先经56℃、30分钟灭能）用含10%灭能新生牛血清的DMEM培养液做3倍系列稀释，即在96孔培养板中每孔预先加入100μl培养液，取50μl供试品加入其中，即为1：3稀释度，充分混合后，吸取50μl加入下一孔100μl培养液中，成为1：9稀释度，如此系列稀释若干孔至适宜稀释度，最后一孔中50μl弃去。
测定法 将稀释后的标准品及供试品各孔中加入中和用病毒，50μl/孔，同时设正常细胞对照孔（只加100μl DMEM于孔中），以及中和用病毒对照孔（含5%灭能新生牛血清的DMEM 100μl，加入中和用病毒50μl），混匀后置37℃中和1小时，每孔加入1×10⁶个/ml的BSR细胞悬液50μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养24小时。待培养结束吸干培养液，每孔中加入PBS100μl清洗并吸干后，每孔加入预冷至4℃的80%丙酮50μl，4℃固定30分钟，或-30℃固定10分钟，弃丙酮，待挥发干燥后加入工作浓度的荧光标记狂犬病病毒核蛋白抗体，50μl/孔，37℃孵育30分钟，弃去液体，用PBS洗板2~3次，甩干，每孔加入80%甘油50μl，荧光显微镜下观察。计算公式如下：


【附注】（1）中和用病毒滴度不得小于10⁶FFU/ml。
（2）病毒稀释时，应尽可能在冰浴中进行。
（3）病毒对照孔应有80%~95%细胞被荧光着色，细胞对照孔应无荧光，试验方可成立。