注射用重组人促红素（CHO细胞）

注射用重组人促红素（CHO细胞）Zhusheyong Chongzu Ren Cuhongsu（CHO Xibao）Recombinant Human Erythropoietin for Injection（CHO Cell）
本品系由高效表达人红细胞生成素（简称人促红素）基因的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，经细胞培养、分离和高度纯化后获得的重组人促红素冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1工程细胞
2.1.1名称及来源
重组人促红素工程细胞系由带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr^—（二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞）细胞系。
2.1.2细胞库建立、传代及保存
由原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。各级细胞库细胞传代应不超过批准的代次。细胞冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。
2.1.3主细胞库及工作细胞库细胞的检定
应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
2.1.3.1外源因子检查
细菌和真菌、支原体、病毒检查均应为阴性。
2.1.3.2细胞鉴别试验
应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。
2.1.3.3人促红素表达量
应不低于原始细胞库细胞的表达量。
2.1.3.4目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）
目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。
2.2原液
2.2.1细胞的复苏与扩增
从工作细胞库来源的细胞复苏后，于含灭能新生牛血清培养液中进行传代、扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。新生牛血清的质量应符合规定（通则3604）。
2.2.2生产用细胞培养液
生产用细胞培养液应不含牛血清和抗生素。
2.2.3细胞培养
细胞培养全过程应严格按照无菌操作。细胞培养时间可根据细胞生长情况而定。
2.2.4分离纯化
收集的培养液采用经批准的超滤法或其他适宜方法进行浓缩，多步色谱纯化后制得高纯度的重组人促红素，除菌过滤后即为人促红素原液。如需存放，应规定时间和温度。
2.2.5原液检定
按3.1项进行。
2.3半成品
2.3.1配制与除菌
原液加入适宜稳定剂，并用缓冲液稀释。除菌过滤后即为半成品。
2.3.2半成品检定
按3.2项进行。
2.4成品
2.4.1分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2分装及冻干
应符合“生物制品分装和冻干规程”及通则0102有关规定。半成品应及时分装、冷冻。冻干的全过程中，制品温度应不高于30℃。
2.4.3规格
应为经批准的规格。
2.4.4包装
应符合“生物制品包装规程”及通则0102有关规定。
3 检定
3.1原液检定
3.1.1蛋白质含量
用4g/L碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5~2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L碳酸氢铵溶液作为空白，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长276~280mn处，测定供试品溶液最大吸光度A_max，将A_max对应波长代入回归方程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A_光散射按下式计算供试品蛋白质含量，应不低于0.5mg/ml。

3.1.2生物学活性
3.1.2.1体内法
依法测定（通则3522）。
3.1.2.2体外法
按酶联免疫法试剂盒说明书测定。
3.1.3体内比活性
每1mg蛋白质应不低于1.0×10⁵IU。
3.1.4纯度
3.1.4.1电泳法
依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。
3.1.4.2高效液相色谱法
依法测定（通则0512）。亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm，粒度10μm，直径7.5mm，长30cm；流动相为3.2mmol/L磷酸氢二納-1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3；上样量应为20~100μg，在波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算的理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。
3.1.5分子量
依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36~45kD。
3.1.6紫外光谱
依法测定（通则0401），用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.5~2mg/ml，在光路1cm、波长230~360nm下进行扫描，最大吸收峰应为279nm±2nm；最小吸收峰应为250nm±2nm；在320~360nm处应无吸收峰。
3.1.7等电聚焦
取尿素9g、30%丙烯酰胺单体溶液6.0ml、40%pH3~5的两性电解质溶液1.05ml、40%pH3~10的两性电解质溶液0.45ml、水13.5ml，充分混匀后，加入N，N，N'，N'-四甲基乙二胺15μl和10%过硫酸铵溶液0.3ml，脱气后制成凝胶，加供试品溶液20μl（浓度应在每1ml含0.5mg以上），照等电聚焦电泳法（通则0541第六法）进行，同时做对照。电泳图谱应与对照品一致。
3.1.8唾液酸含量
每1mol人促红素应不低于10.0mol（通则3102）。
3.1.9外源性DNA残留量
每10000IU人促红素应不高于100pg（通则3407）。
3.1.10 CHO细胞蛋白质残留量
采用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于蛋白质总量的0.05%。
3.1.11细菌内毒素检查、
依法检查（通则1143），每10000IU人促红素应小于2EU。
3.1.12牛血清白蛋白残留量
依法测定（通则3411），应不高于蛋白质总量的0.01%。
3.1.13 肽图
供试品经透析、冻干后，用1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至1.5mg/ml，依法测定（通则3405），其中加入胰蛋白酶（序列分析纯），37℃±0.5℃保温6小时，色谱柱为反相C₈柱（25cmX4.6mm，粒度5μm，孔径30nm），柱温为45℃±0.5℃；流速为每分钟0.75ml；进样量为20μl；按下表进行梯度洗脱（表中A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液）。
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编号
时间/分钟
流速/ml
A/%
B%
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-----------
1
0.00
0.75
100.0 0.0
2
30.00
0.75
85.0
15.0
3
75.00
0.75
65.0
35.0
4
115.00
0.75
15.0
85.0
5
120.00
0.75
0.0
100.0
6
125.00
0.75
100.0 0.0
7
145.00
0.75
100.0 0.0
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肽图应与人促红素对照品一致。
3.1.14 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）
用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：
Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。
3.2半成品检定
3.2.1细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），每1000IU人促红素应小于2EU。
3.2.2无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.3成品检定
除复溶时间、水分测定和装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。
3.3.1鉴别试验
按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
3.3.2物理检查
3.3.2.1外观
应为白色疏松体，复溶后应为无色澄明液体。
3.3.2.2复溶时间
加入标示量的灭菌注射用水，复溶时间应不超过2分钟。 .
3.3.2.3可见异物
依法检查（通则0904），应符合规定。
3.3.2.4装量差异
依法检查（通则0102），皮符合规定。
3.3.3化学检定
3.3.3.1水分
应不高于3.0%（通则0832）。
3.3.3.2pH值
依法测定（通则0631），应符合批准的要求。
3.3.3.3人血白蛋白含量
若制品中加入人血白蛋白作稳定剂，则应符合批准的要求（通则0731第二法）。
3.3.3.4渗透压摩尔浓度
依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
3.3.4生物学活性
3.3.4.1体外法
按酶联免疫法试剂盒说明书测定，应为标示量的80%~120%。
3.3.4.2体内法
依法测定（通则3522），应为标示量的80%~140%。
3.3.5无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.3.6细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），每1000IU人促红素应小于2EU；5000IU/支以上规格的人促红素，每支应小于10EU。
3.3.7异常毒性检查
依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。
4 稀释剂
稀释剂应为灭菌注射用水，稀释剂的生产应符合批准的要求。
灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关要求。
5 保存、运输及有效期
于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
6 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。