注射用重组人白介素-2

注射用重组人白介素-2Zhusheyong Chongzu Ren Baijiesu-2Recombinant Human Interleukin-2 for Injection
本品系由高效表达人白细胞介素-2 （简称人白介素-2） 基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后获得的重组人白介素-2冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 工程菌菌种
2.1.1 名称及来源
重组人白介素-2工程菌株系由带有人白介素-2基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。
2.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
2.1.3 菌种检定
主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
2.1.3.1 划种LB琼脂平板
应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
2.1.3.2 染色镜检
应为典型的革兰氏阴性杆菌。
2.1.3.3 对抗生素的抗性
应与原始菌种相符。
2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做）
应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
2.1.3.5 生化反应
应符合大肠杆菌生化反应特性。
2.1.3.6 人白介素-2表达量
在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
2.1.3.7 质粒检查
该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。
2.1.3.8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）
目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。
2.2 原液
2.2.1 种子液制备
将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。
2.2.2 发酵用培养基
采用适宜的不含抗生素的培养基。
2.2.3 种子液接种及发酵培养
2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。
2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。
2.2.4 发酵液处理
用适宜的方法收集、处理菌体。
2.2.5 初步纯化
采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。
2.2.6 高度纯化
经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，加入适宜稳定剂，除菌过滤后，即为重组人白介素-2原液。如需存放，应规定时间和温度。
2.2.7 原液检定
按3.1项进行。
2.3 半成品
2.3.1 配制与除菌
按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。将原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，保存于2～8℃。
2.3.2 半成品检定 按3.2项进行。
2.4 成品 2.4.1分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装及冻干
应符合“生物制品分装和冻干规程”及通则0102有关规定。
2.4.3 规格
应为经批准的规格。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”及通则0102有关规定。
3 检定
3.1 原液检定
3.1.1 生物学活性
依法测定（通则3524）。
3.1.2 蛋白质含量
依法测定（通则0731第二法）。
3.1.3 比活性
为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于1.0×10⁷IU。
3.1.4 纯度
3.1.4.1 电泳法
依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应 不低于10μg （考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。
3.1.4.2 高效液相色谱法
依法测定（通则0512）。色谱柱以适合分离分子质量为5～60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0（含适宜的表面活性剂）；上样量应不低于20μg，在波长280nm处检测，以人白介素-2色谱峰计算的理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算，人白介素-2主峰面积应不 低于总面积的95.0%。
3.1.5 分子量
依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为15.5kD±l.6kD。
3.1.6 外源性DNA残留量
每1支/瓶应不高于10ng （通则3407）。
3.1.7 宿主菌蛋白质残留量
应不高于蛋白质总量的0.10% （通则3412）。
3.1.8 残余抗生素活性
依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀 释至0.01%再进行测定。
3.1.9 细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），每100万IU应小于10EU。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025%再进行测定。
3.1.10 等电点
主区带应为6.5～7.5，且供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。
3.1.11 紫外光谱
用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至100～500μg/ml，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为277nm±3nm （通则0401）。
3.1.12 肽图
依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。
3.1.13 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）
用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：（Met）-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu-Gln-Leu-Glu。
3.2 半成品检定
3.2.1 细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），每100万IU应小于10EU。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025% 再进行测定。
3.2.2 无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.3 成品检定
除水分测定、装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。
3.3.1 鉴别试验
按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
3.3.2 物理检查
3.3.2.1 外观
应为白色或微黄色疏松体，按标示量加入灭菌注射用水后应迅速复溶为澄明液体。
3.3.2.2 可见异物
依法检查（通则0904），应符合规定。
3.3.2.3 装量差异
依法检查（通则0102），应符合规定。
3.3.3 化学检定
3.3.3.1 水分
应不高于3.0% （通则0832）。
3.3.3.2 pH 值
应为6.5～7.5 （通则0631）。如制品中不含SDS，应为3.5～7.0。
3.3.3.3 渗透压摩尔浓度
依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
3.3.4生物学活性
应为标示量的80%～150% （通则3524）。
3.3.5 残余抗生素活性
依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.01%再进行测定。
3.3.6 无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.3.7 细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。如制品中含有SDS，应将SDS浓度至少稀释至0.0025%再进行测定。
3.3.8 异常毒性检查
依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。
3.3.9 乙腈残留量
如工艺中采用乙腈，则照气相色谱法（通则0521）进行。色谱柱采用石英毛细管柱，柱温45℃，气化室温度150℃，检测器温度300℃，载气为氮气，流速为每分钟4.0ml，用水稀释乙腈标准溶液使其浓度为0.0004%，分别吸取1.0ml上述标准溶液及供试品溶液顶空进样400μl，通过比较标准溶液和供试品溶液的峰面积判定供试品溶液乙腈含量。乙腈残留量应不高于0.0004%。
4 稀释剂
稀释剂应为灭菌注射用水，稀释剂的生产应符合批准的要求。
灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关要求。
5 保存、运输及有效期
于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
6 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。