注射用重组人白介素-11

注射用重组人白介素-11Zhusheyong Chongzu Ren Baijiesu-11Recombinant Human Interleukin-11 for Injection
本品系由高效表达人白细胞介素-11（简称人白介素-11）基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后获得的重组人白介素-11冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 工程菌菌种
2.1.1 名称及来源
重组人白介素-11工程菌株系由带有人白介素-11基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。
2.1.2 种子批的建立
种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定，各级种子批的传代应符合批准的要求。
2.1.3 菌种检定
主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
2.1.3.1 划种LB琼脂平板
应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
2.1.3.2 染色镜检
应为典型的革兰氏阴性杆菌。
2.1.3.3 对抗生素的抗性
应与原始菌种相符。
2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做）
应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
2.1.3.5 生化反应
应符合大肠杆菌生化反应特性。
2.1.3.6 人白介素-11表达量
在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
2.1.3.7 质粒检查
该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。
2.1.3.8 目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）
目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符
2.2 原液
2.2.1 种子液制备
将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。
2.2.2 发酵用培养基
采用适宜的不含抗生素的培养基。
2.2.3 种子液接种及发酵培养
2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。
2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。
2.2.4 发酵液处理
用适宜的方法收集、处理菌体。
2.2.5 初步纯化
采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。
2.2.6 高度纯化
经初步纯化后，采用经批准的纯化工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，加入适宜稳定剂，除菌过滤后即为人白介素-11原液。如需存放，应规定保存温度和时间。
2.2.7 原液检定
按3.1项进行。
2.3 半成品
2.3.1 配制与除菌
按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。将原液用稀释液稀释至所需浓度，除菌过滤后即为半成品，保存于2～8℃。
2.3.2 半成品检定
按3.2项进行。
2.4 成品
2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装及冻干
应符合“生物制品分装和冻干规程”及通则0102有关规定。
2.4.3 规格
0.75mg（600万U）/瓶；1mg（800万U）/瓶；1.5mg（1200万U）/瓶；2mg（1600万U）/瓶；3mg（2400万U）/瓶；5mg（4000万U）/瓶。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”及通则0102有关规定。
3 检定
3.1 原液检定
3.1.1 生物学活性
依法测定（通则3532）。
3.1.2 蛋白质含量
采用Lowry法（通则0731第二法）或高效液相色谱法（通则0512）测定。
采用高效液相色谱法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温30℃±5℃，供试品保存温度为2～8℃；以0.1%三氟乙酸的水溶液为流动相A液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B液；流速为1.0ml/min；检测波长214nm；按下表进行梯度洗脱。
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时间（分钟） A （ % ）
B （ % ）
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0
100
0
2
70
30
40
30
70
42
70
30
50
100
0
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检测法 取标准品和供试品，用流动相A复溶或稀释至相同蛋白浓度，将供试品与标准品以相同体积分别注入液相色谱仪（进样体积不小于10μl，进样量4～6μg），按上表进行梯度洗脱。标准品溶液、供试品溶液均进样3次，记录色谱图并计算峰面积。按外标法以峰面积计算供试品中白介素-11的含量。
3.1.3 比活性
为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于8.0×10⁶U。
3.1.4 纯度
3.1.4.1 电泳法
依法测定（通则0541第五法）。取供试品溶液（不进行水浴加热处理），用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。
3.1.4.2 高效液相色谱法（反相色谱法）
依法测定（通则0512）。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：量取1.0ml三氟乙酸加入100ml水再加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（55%～80%B相，0～40分钟）。上样量约为20μg，检测波长为214nm，理论板数按人白介素-11峰计算不低于1500。按面积归一化法计算，重组人白介素-11主峰面积应不低于总面积的95.0%。
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时间（分钟） 流动相A （%） 流动相B （ % ）
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0
45
55
40
20
80
45
0
100
50
0
100
52
45
55
60
45
55
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3.1.4.3 高效液相色谱法 （分子排阻色谱法）
依法测定（通则0512）。色谱柱以适合分离分子质量为5～150kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量应不低于20μg，检测波长为280nm。理论板数按人白介素-11峰计算不低于1500。按面积归一化法计算，重组人白介素-11主峰面积应不低于总面积的95.0%。
3.1.5 分子量
依法测定（通则0541第五法）。取供试品溶液（不进行水浴加热处理），用还原型SD&聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0μg，制品的表观分子量应与对照品的一致，经对照品分子量校正，制品的分子质量应为19.0kD±l.9kD。
3.1.6 外源性DNA残留量
每1支/瓶应不高于10ng （通则3407）。
3.1.7 宿主菌蛋白质残留量
应不高于蛋白质总量的0.05% （通则3412）。
3.1.8 残余抗生素活性
依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。
3.1.9 细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。
3.1.10 羟胺残留量
如制品工艺中采用羟胺，则照羟胺残留量测定法（通则3209）进行。每1.0mg蛋白质应小于100nmol。
3.1.11 等电点
依法测定（通则0541第六法），等电点图谱应与对照品一致。
3.1.12 紫外光谱
用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.3～0.7mg/ml，在光路1cm、波长230～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为280nm±3nm（通则0401）。
3.1.13 肽图
依法测定（通则3405），肽图图谱应与对照品图形一致。
3.1.14 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）
用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：（Met-Pro）-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala。
3.2 半成品检定
3.2.1 细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。
3.2.2 无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.3 成品检定
除水分测定、装量差异检查外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。
3.3.1 鉴别试验
按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
3.3.2 物理检查
3.3.2.1 外观
应为白色或类白色疏松体。
3.3.2.2 溶液的澄清度
取本品，按标示量加入灭菌注射用水，复溶后溶液应澄清。如显浑浊，应与1号浊度标准液（通则0902）比较，不得更浓。
3.3.2.3 可见异物
依法检查（通则0904），除允许有少量细小蛋白质絮状物或蛋白质颗粒外，其余应符合规定。
3.3.2.4 装量差异
依法检查（通则0102），应符合规定。
3.3.3 化学检定
3.3.3.1 水分
应不高于3.0% （通则0832第一法）。
3.3.3.2 pH 值
应为6.5～7.5 （通则0631）。
3.3.3.3 渗透压摩尔浓度
依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
3.3.4 甘氨酸含量
如制品中加甘氨酸，则依法测定（通则0512），应符合批准的要求。
3.3.5 蛋白质含量
按3. 1.2项进行，应为标示量的80%～120%。
3.3.6 生物学活性
依法测定（通则3532），应为标示量的80%～150%。
3.3.7残余抗生素活性
依法测定（通则3408），不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。
3.3.8 无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.3.9 细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），每1支/瓶应小于10EU。
3.3.10异常毒性检查
依法检查（通则1141小鼠试验法），应符合规定。
4 稀释剂
稀释剂应为灭菌注射用水，稀释剂的生产应符合批准的要求。
灭菌注射用水应符合本版药典（二部）的相关要求。
5 保存、运输及有效期
于2～8℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
6 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。