聚乙二醇牛血红蛋白偶联物

0人阅读 0人评论收藏 2017/2/10 11:41:59 作者: 兽药典委员会来源: 国家兽药标准

聚乙二醇牛血红蛋白偶联物

Juyrerchun Niuxuehong Danbai，OuLianwu
Poly （ethylene glycol） conjugated bovine hemog10bin

本品系由鲁西黄牛血红蛋白（bovine hemog10bin，bHb）经5000分子量的单甲氧基聚乙二醇（monomethoxypoly （ethyleneglycol），mPEG）修饰剂共价修饰，并经DV50膜除病毒和巴氏热灭活法灭活病毒的液体制剂。聚乙二醇牛血红蛋白偶联物（PEG-bHb）纯度不低于99.9%，不含防腐剂和抗生素。

【性状】本品为红色澄明液体，不应有异物、浑浊和沉淀。

【检查】pH值取本品，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每ml含蛋白质0.1g的溶液，依法测定（附录51页），pH值应为7.2-7.6。

PEG-bHb纯度照SE-HPLC测定原液及产品纯度法（附1）测定，在416nm波长处检测，PEG-bHb含量应不低于99.9%。

游离铁离子照PEG-bHb游离铁离子含量测定法（附2）测定，每1ml中游离铁离子的含量应不得过4.0μg。

高铁血红蛋白取在4°C保存的供试品0.5ml，将样品快速注入血气分析仪ABL520样品池，自动检测，高铁血红蛋白含量应不得过8.0%。

平均修饰度照PEG-bHb平均修饰度测定法（附3）测定，平均修饰度应为22%-28%。

特征光谱分析取本品，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml中含血红蛋白0.5g的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录23页），在200-800nm的范围内测定，在277nm、346nm、414nm、 541nm、576nm波长处有吸收峰，在414nm的波长处有最大吸收。

平均分子量照PEG-bHb平均分子量测定法（附4）测定，平均分子量应为110-140kDa。

胶体渗透压用胶体渗透压计（4420 Col10id Osmorneter，Wescor，美国）测定，应为110-160mmHg。

黏度照黏度测定法（附录48页，第三法）测定，水浴温度为37°C±1°C，按下式计算，应为 3. 5-6.0cP。

T:供试品平均流出时间

T₀：水平均流出时间

η⁰:水的黏度（0.6947cP，37°C）

氧亲和力（P5。值）照P5。值测定法（Hemox-Analyzer）（附5）测定，P5。值应为10.0-14.0mmHg。

晶体渗透压用晶体渗透压计（Advanced 3Moplus，美国）测定，应为300-360Mosm。

细菌内毒素照《中国生物制品规程（2004版）》附录《生物制品细菌内毒素试验规程》凝胶法进行。每1ml中含细菌内毒素的量应小于1.0 EU。

热原质照《中国生物制品规程（2004年版）》通则《生物制品热原质试验规程》进行。剂量按家兔每lkg体重10ml，应符合规定。

抗原残留位点照抗原残留位点试验（ELISA）法（附6）检测，抗原残留量应不低于23%。

无菌按《中国生物制品规程（2004版）》附录《生物制品无菌试验规程》直接接种法检测，应符合规定。

异常毒性按《中国生物制品规程（2004版）》附录《生物制品异常毒性试验规程》检验，应符合规定。

牛腹泻病毒抗原取本品，按国家批准的牛病毒性腹泻抗原检测ELISA试剂盒检测，应为阴性。

牛白血病病毒取本品，照牛白血病病毒检测（附7）测定，应为阴性。

支原体取混匀的供试品8ml，加硫酸铵3.8g，缓缓振荡使硫酸铵完全溶解，4°C以下8000g离心10分钟，上清液经除菌滤器滤过，照《中国生物制品规程（2004版）》附录支原体检查，应符合规定。

装量照最低装量检查法（附录67页）检查，应符合规定。

血红蛋白含量照血红蛋白浓度测定法（附8）测定，每1ml中含血红蛋白的量应为0.0550-0.060g。

【作用与用途】本品具有携放氧和增加血循环容量的双重作用。主要用于治疗犬急性失血和失血性休克。【用法与用量】静脉输注：使用量一般为失血量的50%。兽医可根据情况酌情考虑。

【不良反应】长期毒性研究发现，给药1周后少数动物出现局部脱毛，食量减少，体重增长减慢。给药结束后，食量逐渐恢复，体重增长加快，停药5周后，基本恢复正常。大量使用会出现稀释性凝血时间滞后。

【注意事项】（1）当发现有浑浊、沉淀、异物及超过有效期，请勿使用。

本品开启后应一次注射完毕，不得分次或给其他动物使用。

输注过程中如发现动物有不适反应，应立即停止输注。

禁止将本品同含蛋白水解酶或酒精的注射液混合使用，以免蛋白变性。

孕期动物慎用。

【规格】25ml

【贮藏与有效期】一28°C冷冻条件下保存1年，2-8°C复溶后应在4周内用完。

【生产企业】

附1

SE - HPLC测定原液及产品纯度

1实验材料和仪器

1.1高效液相色谱系统（如：HP1100高效液相色谱工作站，US）。

1.2色谱柱：亲水硅胶高效体积排阻色谱（SE-HPLC）柱（如：GF-250, Agilent）。

1.3流动相：磷酸盐缓冲液（pH值7.0）（0.15mol氯化钠+0.005mol磷酸二氢钠-1L水）。

2待检样品的处理

用流动相将待检样品稀释至4mg/ml，用0.22μm水溶性膜过滤。

3试验步骤

3.1系统适用性试验取PEG-bHb样品和bHb样品，用流动相稀释成制成每1ml中含5mg的溶液，量取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

3.2测定法用流动相以每分钟1ml流速平衡系统至基线平稳。取处理过的待测样品5μl上柱，用流动相以1ml/min流速洗脱，同时在紫外检测器280nm （原液）或416nm （成品）波长下记录色谱图及有关数据。记录数据的时间为30分钟。

4结果计算

用高效液相色谱系统自备软件对所得色谱图进行面积积分。根据标准品确定原液血红蛋白和成品血红蛋白的位置进行判定。用归一化法计算样品的纯度。

附2

PEG-bHb游离铁离子含量测定（等离子体质谱）

1试验原理

利用离心式浓缩管离心收集待测样品中的游离铁离子，通过等离子体质谱测定其中游离铁离子的含量。

2试验材料等离子体质谱 manosep离心式浓缩管 3试验步骤

3.1取待测样品0.5ml，经截留3kDa分子量的超滤离心管（manosep，PALL），4°C 5000转/分离心20分钟，收集滤过清液。

3.2滤过清液用纯水稀释100倍，4°C保存。

3.3进行等离子体质谱检测。

4结果计算

样品铁离子含量（μg/ml）=稀释后样品所测得铁离子含量×100

附3

PEG-bHb平均修饰度测定（三硝基苯磺酸法）

1试验原理

M-PEG修饰剂与牛血红蛋白表面赖氨酸的氨基反应，生成PEG-bHb。故可以利用三硝基苯磺酸（TNBS）与蛋白质或多肽中赖氨酸的e-氨基发生反应形成三硝基酚衍生物，在特定波长（303- 420mn）下产生特异性吸收峰的性质，检测产品在修饰反应前后化学修饰剂与赖氨酸e-氨基的结合情况，从而推导出产品的修饰度（％）。

2.试验材料

2.1仪器设备

紫外-可见分光光度计

恒温水浴

容量瓶

移液管

具塞试管

2.2化学试剂

30mmol/L 三硝基苯磺酸（TNBS）溶液（TNBS: Cat#P2297, Sigma，5%液体，纯度95%）

0.1mol/L 硼酸钠（Na₂B₄0₇）溶液甲酸

3.试验步骤

3.1样品稀释

用0.1mol/L硼酸钠溶液将待测样品及天然血红蛋白各稀释100倍后待用。

3.2浓度校正

利用两个样品在280nm波长下的吸光值进行浓度校正，以衡量稀释过程可能产生的误差。

取待测样品稀释液及天然血红蛋白稀释液各5ml，分别测定其在280nm下的吸光度值

A_PEG-bHb，A_bHb。

设定：a =A_bHb/A_PEG-bHb。

3.3样品检测

3.3.1取稀释后的天然血红蛋白和供试品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管中，分别加入30mmol/L的三硝基苯磺酸溶液0.1ml，并补加0.1mol/L硼酸钠溶液使每试管的总体积达到5ml。

3.3.2将样品避光水浴（37°C） 30分钟，加入50%甲酸溶液2ml终止反应，立即在347mn的波长处测定各样品的吸光值。

3.3.3以蛋白溶液加样体积为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制关系曲线，测量其斜率。

成品 Y₁=K₁X-B₁

天然血红蛋白 Y₂=K₂X+B₂

4结果计算

修饰度=（K₂-a×K₁） /A₂×100%

附4

PEG - bHb平均分子量测定
（凝胶色谱-多角度激光散射检测器联用法）

1试验原理

PEG - bHb的SE-HPLC峰形重复性好，因此利用SE-HPLC对产品进行分级，采用多角度激光散射检测器（Wyatt, US）与示差检测器（Wyatt, US），得到对应于SE-HPLC不同保留时间的分子量，运用ASTRA软件（Wyatt，US）得到产品的平均分子量。

2试验材料高效液相色谱

凝胶过滤柱（GF250, Zorbax）

Optilab DSP 示差检测器，Wyatt Techno10gy

Dawn EOS多角度激光散射检测器，Wyatt Techno10gy

二水合磷酸二氢钠

十二水合憐酸氢二钠

氯化钠

3.试验步骤

按照附录6“SE-HPLC测定原液及产品纯度”方法进行。首先用流动相以每分钟1ml流速平衡系统（含多角度激光检测器、示差检测器）至各检测器基线平稳。取处理过的待测样品5μ1上柱，用流动相以每分钟1ml流速洗脱，在紫外检测器416mn波长下记录色谱图，采用ASTRA软件收集多角度激光检测器及示差检测器数据，收集时间30分钟。

4.结果处理

根据PEG-bHb标准品416nm出峰时间（起峰位置至峰尾）选择处理区域，运用ASTRA软件计算平均分子量（数均，Mn）。

附5

P50 值测定方法（Hemox?- Analyzer）

1设备原理

Hemox?-Analyzer （TCS Scientific Co，US）利用双波长光度计测量样品中氧合血红蛋白的含量，利用Clark氧电极测量测试溶液中的氧分压值，以得到测试样品的氧合血红蛋白含量随氧分压的变化曲线，即氧平衡曲线。

根据氧平衡曲线（本方法确定为氧合曲线），可以确定测试样品氧饱和度为50%时的氧分压，即样品的P50值。以此作为判断测试样品携放氧能力的依据之一。

2试验材料 2.1试验设备

HEMOX?- ANALYZER, TCS Scientific Co. , USA

ALLEN Datagraph 记录仪及键盘，ALLEN Datagraph 公司

氮气瓶

压缩空气瓶

2.2化学试剂

氯化钠

氯化钾

氢氧化钠

Hemox缓冲液（按TCS公司配方配制，取氯化钠7.89g，三羟甲基-2-氨基乙磺酸（TES） 6.89g，氯化钾0.37g，溶于超纯水，并定容至1升。在37°C用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至 7.4，溶液的渗透压为297mOsmol/kg，用0.2μm膜滤过，4°C保存）

22%牛白蛋白（BSA）溶液（TCS公司提供）

消泡剂溶液[取二甲基聚硅氧烷（DMPS） 0.1g，用Hemox缓冲液溶解并稀释至100ml，4°C保存]

3试验步骤 3.1开机前的准备

3.1.1检查氮气瓶，压缩空气瓶压力均在l0psi。

3.1.2检查气体接线是否漏气（用肥皂水或其他液体）。

3. 2开机和校正

3. 2. 1依次打开电源开关、温度开关及P0₂开关。

3. 2. 2将装有蒸馏水的样品管放入检测区，将取样管插入样品管中，开关拨至FILL，使水进入样品池。 3.2.3气体选择开关拨至AIR位，充入空气使样品氧饱和，设定样品室温度为37°C。

3.2.4待温度显示达37°C后，将旋钮转至P0₂位，当P0₂读数稳定后，调节‘P02ADJUST’按钮，使P0₂显示值为150。

3.2.5把气体开关调至‘N₂’，使样品脱氧，P0₂读数应能达到1.0-2.0,如果达不到，考虑更换P0₂电极薄膜。

3.3样品检测

3.3.1样品准备

在样品管中加入Hemox缓冲液4ml，22%BSA溶液20μ1，消泡剂10μ1。然后加入待测样品10Oμg，混合均匀。

3.3.2样品检测

3.2.1将进样管插入样品管，开关拨到‘FILL’位，使样品完全吸入样品池，气体选择开关拨至AIR位。

3.2.2.2温度到37°C后，当P0₂显示数值稳定不变时，调节P0₂读数为150mmHg。

3.2.2.3调节S₁/S₂读数等于±0.00。

2. 2. 4把气体开关拨到‘N₂’，开始充入氮气，启动脱氧过程。

2. 2. 5当记录笔达到X-轴零点后，调节记录笔达到左下角零点（0.0）。

3.2.2.6将气体开关拨至‘AIR’，开始氧合，直到P0₂读数达到145-150mmHg。

4结果确定

读取氧合曲线在50%氧合度时对应的氧分压值，即该样品的P50值（mmHg）。

附6

抗原残留位点试验（ELISA法）

1试剂

1.1包被液：pH值9.6, 0.1mol/L碳酸缓冲液 1.2洗板液：PBS-T

稀释液：1%BSA-PBS-T

封闭液：1%BSA-PBS-T

1.5底物溶液：ImgOPD+5μl双氧水+ 10ml0.1m柠檬酸缓冲液（pH4.5）

1.6终止液：2mol/L硫酸 2试验步骤 2.1包被

2.1.1以bHb为标准品，将相同批号的待检bHb和PEG - bHb用包被液稀释为下列浓度：5.0μg/ml、4.0μg/ml、3.0μg/ml、2.0μg/ml 1.0μg/ml、0.5μg/ml 阴性对照 BSA: 12.0μg/ml。

2.1.2每孔加入50μ1，每个浓度2个平行孔。37°C，温育2小时。

2.2封闭

将上述包被液甩干。用洗板液清洗3次。每次洗完后，将残留溶液拍干。加入封闭液300μl/孔，37°C，温育2小时。

2.3加入一抗

将上述封闭液甩干，将残留溶液拍干。将兔抗bHb抗体用稀释液500倍稀释。每孔加入上述抗体50μl，37°C，温育2小时。

2.4加入二抗

将一抗液甩干。用洗板液清洗5次。每次洗完后，将残留溶液拍干。将羊抗兔-HRP抗体用稀释液10000倍稀释。每孔加入上述抗体50μl, 37°C，温育1小时。

2.5显色和测量

将二抗液甩干。用洗板液清洗5次。每次洗完后，将残留溶液拍干。每孔加入底物溶液100μl，室温避光l0min。每孔加入终止溶液10μ1，在酶联仪上测量492nm处吸光值。

3结果计算

分别求出bHb和PEG-bHb的直线回归方程。将PEG-bHb的吸光值代入方程，求出PEG-bHb相当于bHb的量。

抗原性残留（％）=相当于bHb的量/PEG-bHb量

附7

个白血病病毒检测

1试验原理

基于酶联免疫吸附试验（ELISA）及反转录PCR （RT-PCR）方法同时对原料血中的抗牛白血病毒抗体及核酸进行检测。以提取的牛白血病毒（BLV）前病毒DNA （Pro-DNA）作为扩增时的阳性对照，以蓝舌病病毒（BTV）总RNA的提取及RT-PCR为获得病毒cDNA的方法对照。

2试验材料

2.1样品及原料血

聚乙二醇牛血红蛋白偶联物（PEG-bHb）样品为北京凯正生物工程发展有限责任公司产品。原料血样采自北京郊区某牛场饲养的用于制备PEG-bHb的健康鲁西黄牛。

2.2对照品

BLVPm-DNA来自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所吴东来教授，蓝舌病毒（BTV5毒株）为军事医学科学院野战输血研究所分离培养。

2.3引物

用于BLV核酸检测的套式外引物为BLV-A和BLV-B，内引物为BLV-C和BLV-D，为用

于调控蛋白tax区片段扩增用引物。用于BTV检测的引物PI （NS1-1）为位于NS1基因（S6） 5’

端10-30碱基序列，序列见表。	P2 （NS1-2）	为位于NSI基因5’端110 - 130碱基序列的反向互补序列。具体用于扩增mx及NS；基因的引物
引物	基因	序列
BLV-A	tax	5^, - CAGACACCAGGGGAGCCATA - 3’
BLV-B	tax	5’- CTGCTAGCAACCAATTTCGGA - 3，
BLV-C	tax	5’- AGCCATACGTTATCTCTCCA - 3’
BLV-D	tax	5^, - CAGGTTAGCGTAGGGTCATG - 3，
BTV-P1	NS₁	5’- GTGACTGCAAGTCCATTGAGG - 3，
BTV-P2	NS₁	5_, _ GTTCTCTAGTTGGCAACCACC_ 3，

2.4试剂

BLV 抗体检测试剂盒为 IDEXX 公司产品；Body-fluid viral DNA/Viral RNA Mini-prep kit为

AXYGEN 公司产品；Ribonuclease inhibito r、Taq 酶、dNTP 为 TaKaRa公司产品；AMV Reverse Transcriptase 为 Promega公司产品。

3试验步骤

3.1原料血中BLV抗体的检测

原料血样的前处理及抗体检测按试剂盒说明进行，每个样品同时测3次取平均值判定结果。

3.2 PEG-bHb样品及BTV对照品的处理

PEG-bHb样品从一70°C冰箱中取出，室温融化备用。BTV经BHK-21细胞培养病变达80%以上时，8OOO×g离心30分钟，无菌条件下取上清于另一离心管暂置于室温，细胞沉淀反复冻融三次，将上清加入经冻融的细胞中，吹打混匀，8 000Xg离心30分钟，取上清用于BTVRNA的提取。

3.3 RNA提取

取PEG - bHb样品及BTV对照品各125μ1分别提取总RNA，具体操作方法按试剂盒说明书进行。

3.4反转录合成cDNA

取经提取的样品及BTV RNA扣1，加下游特异性引物（BLV-B及P2） 2μ1，混匀，97°C水浴5分钟，迅速置冰水上5分钟，在冰盒上加入Buffer 4μl、dNTP（2. 5mM each） 4μ1、AMV Reverse Tran- scriptaselμl、RNasinO.5μ1，混匀，42°C保温1小时。然后75°C5分钟灭活，一20°C保存备用。

3.5 PCR扩增

25/lJ反应体系分别扩增样品20050401、20050402、20050403及BTVcDNA。反应体系如下：10X PCRBuffer2.5μl，dNTP （2.5mMeach） 2μl，上游引物 lμl （BLV-A 及 P1），下游引物1μl（BLV- B 及 P₂），cDNA5μl，TaKaRaTaq^TMlμl，ddH20 12.5μl。反应条件：BTVcDNA 扩增条件 94°C5 分钟；94°C 45 秒，45°C 45 秒，72°C 1 分钟（35cycles）； 72°C 7 分钟；4°C pause；样品及 Pro-DNA 扩增条件为 94°C 5 分钟；94°C 45 秒，55°C 45 秒，72°C 1 分钟（35cycles）； 72°C 7 分钟；4°C pause。样品及Pro-DNA首次扩增的产物分别取1μ1利用内引物（BLV-C和BLV-D）进行第二次扩增，反应条件同上。

4结果及判定

4.1抗体检测结果判定

血清样品的S/P值小于0.5判为阴性，S/P值大于或等于0.5判为抗体有反应，需进一步筛选确证。

4.2核酸检测结果判定

电泳结果，BLVPro-DNA及BTV对照分别扩出120bp及320bp条带结果有效。样品扩出120bp 特异的条带判为阳性，未扩出判为阴性。

附8

血红蛋白浓度测定法（氰化高铁法，HiCN法）

1试验原理

血红蛋白在碱性条件下与DRABKIN’s试剂反应，转化为氰化高铁血红蛋白（HiCN）。氰化高铁血红蛋白在540nm处有特征吸收，在此波长下测定待测样品光吸收值，通过用HiCN标准品制备的标准曲线可求得样品中血红蛋白总浓度。

2试验材料 DRABKIN’S 试剂 BRIJ - 35 溶液血红蛋白标准品注射用水3试验步骤

3.1制备标准曲线

3.1.1 DRABKIN’s溶液的酉己制