重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)Chongzu Yixing Ganyan Yimiao (Niangjiu Jiaomu)Recombinant Hepatitis B Vaccine(Saccharomyces cerevisiae)本品系由重组酿酒酵母表达的乙型肝炎(简称乙肝) 病毒表面抗原(HBsAg)经纯化,加入铝佐剂制成。用于预防乙型肝炎。
1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 生产用菌种
2.1.1 名称及来源
生产用菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿洒酵母原始菌种,菌种号为2150-2-3 (pHBS56-GAP347/33)。
2.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
由美国默克公司提供的菌种经扩增1代为主种子批,主种子批扩增1代为工作种子批。
2.1.3 种子批菌种的检定
主种子批及工作种子批应进行以下全面检定。
2.1.3.1 培养物纯度
培养物接种于哥伦比亚血琼脂平板和酶化大豆蛋白琼脂平板,分别于20~25℃和30~35℃培养5~7天,应无细菌和其他真菌被检出。
2.1.3.2 HBsAg基因序列测定
HBsAg基因序列应与原始菌种2150-2-3保持一致。
2.1.3.3 质粒保有率
采用平板复制法检测。将菌种接种到复合培养基上培养,得到的单个克隆菌落转移到限制性培养基上培养,计算质粒保有率,应不低于95%。
PR (%) =A/(A+L)*100
式中 PR为质粒保有率,%;
A为在含腺嘌呤的基本培养基上生长的菌落数, CFU/皿;
A+L为在含腺嘌呤和亮氨酸的基本培养基上生长的菌落数,CFU/皿。
2.1.3.4 活菌率
采用血细胞计数板,分别计算每1ml培养物中总菌数和活菌数,活菌率应不低于50%。
活菌率(%) =活菌数/总菌数*100
2.1.3.5 抗原表达率
取种子批菌种扩增培养,采用适宜的方法将培养后的细胞破碎,测定破碎液的蛋白质含童(通则0731第二法),并采用酶联免疫法或其他适宜方法测定HBsAg含量。抗原表达率应不低于0.5%。
抗原表达率(%)=抗原含量/蛋白质含量*100
2.1.4 菌种保存
主种子批和工作种子批菌种应于液氮中保存,工作种子批菌种于-70℃保存应不超过6个月。
2.2 原液
2.2.1 发酵
取工作种子批菌种,于适宜温度和时间经锥形瓶、种子罐和生产罐进行三级发酵,收获的酵母菌应冷冻保存。
2.2.2 培养物检定
2.2.2.1 培养物纯度
按2.1.3.1项进行。
2.2.2.2 质粒保有率
按2.1.3.3项进行,应不低于90%。
2.2.3 培养物保存
于-60℃以下保存不超过6个月。
2.2.4 纯化
用细胞破碎器破碎酿酒酵母,除去细胞碎片,以硅胶吸附法粗提HBsAg,疏水色谱法纯化HBsAg,用硫氰酸盐处理,经稀释和除菌过滤后即为原液。
2.2.5 原液检定
按3.1项进行。
2.2.6 原液保存
于2~8℃保存不超过3个月。
2.3 半成品
2.3.1 甲醛处理
原液中按终浓度为100μg/ml加入甲醛,于37℃保温适宜时间。
2.3.2 铝吸附
每1μg蛋白质和铝剂按一定比例置2~8℃吸附适宜的时间,用无菌生理氯化钠溶液洗涤,去上清液后再恢复至原体积,即为铝吸附产物。
2.3.3 配制
蛋白质浓度为20.0~27.0μg/ml的铝吸附产物可与铝佐剂等量混合后,即为半成品。
2.3.4 半成品检定
按3. 2项进行。
2.4 成品
2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.4.3 规格
每瓶0.5ml或1.0ml。每1次人用剂量0.5ml,含HBsAg 10μg;或每1次人用剂量1.0ml,含HBsAg 20μg。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3 检定
3.1 原液检定
3.1.1 无菌检查
依法检查(通则1101),应符合规定。
3.1.2 蛋白质含量
应为20.0~27.0μg/ml (通则0731第二法)。
3.1.3 特异蛋白带
采用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(通则0541第五法),分离胶胶浓度为15%,上样量为1.0μg,银染法染色。应有分子质量为20~25kD蛋白带,可有HBsAg多聚体蛋白带。
3.1.4 N端氨基酸序列测定(每年至少测定1次)
用氨基酸序列分析仪测定,N端氨基酸序列应为:Met-Glu-Asn-Ile-Thr-Ser-Gly-Phe-Leu-Gly-Pro-Leu-Leu-Val-Leu。
3.1.5 纯度
采用免疫印迹法测定(通则3401),所测供试品中酵母杂蛋白应符合批准的要求;采用高效液相色谱法(通则0512),亲水硅胶高效体积排阻色谱柱;排阻极限1000kD;孔径45nm,粒度13μm,流动相为含0.05%叠氮钠和0.1%SDS的磷酸盐缓冲液(pH7.0);上样量100μl,检测波长280nm。按面积归一法计算P60蛋白质含量,杂蛋白应不高于1.0%。
3.1.6 细菌内毒素检查
应小于10EU/ml (通则1143凝胶限度试验)。
3.1.7 宿主细胞DNA残留量
应不高于10ng/剂(通则3407)。
3.2 半成品检定
3.2.1 吸附完全性
将供试品于6500g离心5分钟取上清液,依法测定(通则3501)参考品、供试品及其上清液中HBsAg含量,以参考品HBsAg含量的对数对其相应吸光度对数作直线回归,相关系数应不低于0.99,将供试品及其上清液的吸光度值代人直线回归方程,计算其HBsAg含量,再按下式计算吸附率,应不低于95%。
P (%) =(1-c
s/c
t)*100
式中 P为吸附率
c
s为供试品上清液的HBsAg含量,μg/ml;
c
t为供试品的HBsAg含量,μg/ml。
3.2.2 化学检定
3.2.2.1 硫氰酸盐含量
将供试品于6500g离心5分钟,取上清液。分别取含量为 1.0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml的硫氰酸盐标准溶液、供试品上清液、生理氯化钠溶液各5.0ml于试管中,每一供试品取2份,在每管中依次加入硼酸盐缓冲液(pH9.2)0.5ml,2.25%氯胺T-0.9%氯化钠溶液0.5ml,50%吡啶溶液(用生理氯化钠溶液配制)1.0ml,每加一种溶液后立即混匀,加完上述溶液后静置10分钟,以生理氯化钠溶液为空白对照,在波长415nm处测定各管吸光度。以标准溶液中硫氰酸盐的含量对其吸光度均值作直线回归,计算相关系数,应不低于0.99,将供试品上清液的吸光度均值代入直线回归方程,计算硫氰酸盐含量,应小于1.0μg/ml。
3.2.2.2 Trito n X-100 含量
将供试品于6500g离心5分钟,取上清液。分别取含量为 5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml的Trito n X-100标准溶液、供试品上清液、生理氯化钠溶液各2.0ml于试管中,每一供试品取2份,每管分别加入5% (ml/ml)苯酚溶液1.0ml,迅速振荡,室温放置15分钟。以生理氯化钠溶液为空白对照,在波长340nm处测定各管吸光度。以标准溶液中Trito n X-100的含量对其吸光度均值作直线回归,计算相关系数,应不低于0.99,将供试品上清液的吸光度均值代入直线回归方程,计算Trito n X-100含量,应小于 15.0 μg/ml。
3.2.2.3 pH 值
应为5.5~7.2(通则0631)。
3.2.2.4 游离甲醛含量
应不高于20μg/ml(通则3207第二法)。
3.2.2.5 铝含量
应为 0.35~0.62mg/ml(通则3106)。
3.2.2.6 渗透压摩尔浓度
应为 280mOsmol/kg±65mOsmol/kg(通则0632)。
3.2.3 无菌检查
依法检查(通则1101),应符合规定。
3.2.4 细菌内毒素检查
应小于5EU/ml(通则1143凝胶限度试验)。
3.3 成品检定
3.3.1 鉴别试验
采用酶联免疫法检查,应证明含有HBsAg。
3.3.2 外观
应为乳白色混悬液体,可因沉淀而分层,易摇散,不应有摇不散的块状物。
3.3.3 装量
依法检查(通则0102),应不低于标示量。
3.3.4 渗透压摩尔浓度
依法测定(通则0632),应符合批准的要求。
3.3.5 化学检定
3.3.5.1 pH 值
应为5.5~7.2(通则0631)。
3.3.5.2 铝含量
应为 0.35~0.62mg/ml(通则3106)。
3.3.6 体外相对效力测定
应不低于0.5(通则3501)。
3.3.7 无菌检查
依法检查(通则1101),应符合规定。
3.3.8 异常毒性检查
依法检查(通则1141),应符合规定。
3.3.9 细菌内毒素检查
应小于5EU/ml(通则1143凝胶限度试验)。
4 保存、运输及有效期
于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起,有效期为36个月。
5 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。
重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)使用说明
【药品名称】
通用名称:重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)
英文名:称:Recombinant Hepatitis B Vaccine (Saccharomyces cerevisciae)
汉语拼音:Chongzu Yixing Ganyan Yimiao (Niangjiu Jiaomu)
【成分和性状】 本品系由重组酿酒酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)经纯化,加入铝佐剂制成。为乳白色混悬液体,可因沉淀而分层,易摇散。
有效成分:乙型肝炎病毒表面抗原。
辅料:应列出全部批准的辅料成分。
【接轴对象】 本疫苗适用于乙型肝炎易感者,尤其是下列人员:
(1) 新生儿,特别是母亲为HBsAg、HBeAg阳性者。
(2) 从事医疗工作的医护人员及接触血液的实验人员。
【作用与用途】 接种本疫苗后,可刺激机体产生抗乙型肝炎病毒的免疫力。用于预防乙型肝炎。
【规格】 每瓶0.5ml或1.0ml。每1次人用剂量0.5ml,含HBsAg 10μg;或每1次人用剂量1.0ml,含 HBsAg 20μg。
【免疫程序和剂量】 (1) 于上臂三角肌肌内注射。
(2) 基础免疫程序为3针,分别在0、1、6月接种。新生儿第1针在出生后24小时内注射。16岁以下人群每1次剂量为10μg,16岁或以上人群每1次剂量为20μg。
【不良反应】
常见不良反应:
—般接种疫苗后24小时内,在注射部位可出现疼痛和触痛,多数情况下于2~3天内自行消失。
罕见不良反应:
(1) 一般接种疫苗后72小时内,可能出现一过性发热反应,一般持续1~2天后可自行缓解。
(2) 接种部位轻、中度的红肿、疼痛,一般持续1~2天后可自行缓解,不需处理。
(3) 接种部位可出现硬结,一般1~2个月可自行吸收。
极罕见不良反应:
(1) 局部无菌性化脓:一般要用注射器反复抽出脓液,严重时(如出现破溃)需扩创清除坏死组织,病时较长,最后可吸收愈合。
(2) 过敏反应:过敏性皮疹、阿瑟反应。阿瑟反应一般出现在接种后10天左右,局部红肿持续时长,可用固醇类药物进行全身和局部治疗。
(3) 过敏性休克:一般在接种疫苗后1小时内发生,应及时注射肾上腺素等抢救措施进行治疗。
【禁忌】 (1) 已知对该疫苗所含任何成分,包括辅料以及甲醛过敏者。
(2) 患急性疾病、严重慢性疾病、慢性疾病的急性发作期和发热者。
(3) 妊娠期妇女。
(4) 患未控制的癫痫和其他进行性神经系统疾病者。
【注意事项】 (1) 以下情况者慎用:家族和个人有惊厥史者、患慢性疾病者、有癫痫史者、过敏体质者。
(2) 使用时应充分摇匀,如疫苗瓶有裂纹、标签不清或失效者、疫苗瓶内有异物者均不得使用。
(3) 疫苗瓶开启后应立即使用。
(4) 应备有肾上腺素等药物,以备偶有发生严重过敏反应时急救用。接受注射者在注射后应在现场观察至少30分钟。
(5) 注射第1针后出现高热、惊厥等异常情况者,一般不再注射第2针。对于母婴阻断的婴儿,如注射第2、3针应遵照医嘱。
(6) 严禁冻结。
【贮藏】 于2~8℃避光保存和运输。
【包装】 按批准的执行。
【有效期】 36个月。
【执行标准】
【批准文号】
【生产企业】
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