重组人表皮生长因子凝胶（酵母）

重组人表皮生长因子凝胶（酵母）Chongzu Ren Biaopi Shengzhangyinzi Ningjiao（Jiaomu）Recombinant Human Epidermal Growth Facto r Gel（Yeast）
本品系由高效表达人表皮生长因子基因的毕赤酵母，经发酵、分离和高度纯化后获得的重组人表皮生长因子加入凝胶基质制成。含适宜稳定剂、防腐剂，不含抗生素。
1基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2制造
2.1工程菌菌种
2.1.1名称及来源
重组人表皮生长因子工程菌株系由带有人工合成的人表皮生长因子基因的重组质粒转化的毕赤酵母菌株。
2.1.2种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
2.1.3菌种检定
主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
2.1.3.1划种BMG1琼脂平板
应呈典型酵母菌菌落形态，无其他杂菌生长。
2.1.3.2染色镜检
呈典型的酵母菌形态，应形状规则，用亚甲蓝染色，无死亡细胞。
2.1.3.3筛选标志检查
应符合该基因表型特征。
2.1.3.4人表皮生长因子表达量
在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
2.1.3.5人表皮生长因子基因稳定性检查
涂BMG1琼脂平板，挑选至少50个克隆，用PCR检测人表皮生长因子基因，阳性率应不低于95%。
2.2原液
2.2.1种子液制备
将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基中培养。
2.2.2发酵用培养基
采用适宜的不含抗生素的培养基。
2.2.3种子液接种及发酵培养
2.2.3.1在灭菌培养基中接种适量种子液。
2.2.3.2在适宜温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。
2.2.4发酵液处理
用适宜的方法收集、处理上清液。
2.2.5纯化
采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到3.1项要求，除菌过滤后即为重组人表皮生长因子原液。如需存放，应规定时间和温度。
2.2.6原液检定
按3.1项进行。
2.3半成品
采用的基质应符合凝胶剂基质要求（通则0114）。
2.3.1配制
按经批准的配方进行配制。
2.3.2凝胶制备
按经批准的工艺进行。凝胶应均匀、细腻，在常温时保持胶状，不干涸或液化。
2.3.3半成品检定
按3.2项进行。
2.4成品
2.4.1分批
符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2分装
符合“生物制品分装和冻干规程”及通则0114有关规定。
2.4.3规格
应为经批准的规格。
2.4.4包装
应符合“生物制品包装规程”和通则0114有关规定。
3检定
3.1原液检定
3.1.1生物学活性
依法测定（通则3528）。
3.1.2蛋白质含量
依法测定（通则0731第二法）。
3.1.3比活性
为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于5.0×10^5 IU。
3.1.4纯度
3.1.4.1电泳法
依法测定（通则0541第五法）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。
3.1.4.2高效液相色谱法
依法测定（通则0512）。色谱柱采用丁基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：量取0.5ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：量取0.5ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（22%~37%B相），上样量应不低于5μg，在波长280nm处检测，以人表皮生长因子色谱峰计算的理论板数应不低于500。按面积归一化法计算，人表皮生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0%。
3.1.5分子量
依法测定（通则0541第五法）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为45%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为5.9kD土0.6kD。
3.1.6外源性DNA残留量
每1支/瓶应不高于10ng（通则3407）。
3.1.7宿主菌蛋白质残留量
应不高于蛋白质总量的0.1%（通则3414）。
3.1.8甲醇含量
应不高于0.002%（通则0521）。
3.1.9等电点
主区带应为4.0~5.0，且供试品的等电点图谱应与对照品的一致（通则0541第六法）。
3.1.10紫外光谱
用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至100~50μg/ml，在光路1cm、波长230~360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为277nm±3nm（通则0401）。
3.1.11肽图
依法测定（通则3405），应与对照品图形一致。
3.1.12 N端氨基酸序列（至少每年测定1次）
用氨基酸序列分析仪测定，N端序列应为：
Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu。
3.1.13鉴别试验
按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
3.2半成品检定
3.2.1生物学活性
应按经批准的方法预处理供试品，依法测定（通则3528），应符合要求。
3.2.2无菌检查
应按经批准的方法预处理供试品，依法检查（通则1101），应符合规定。
3.3成品检定
除外观、装量检查外，应按经批准的方法预处理供试品后，进行其余各项检定。
3.3.1鉴别试验
按免疫印迹法（通则3401）或免疫斑点法（通则3402）测定，应为阳性。
3.3.2物理检查
3.3.2.1外观
应为无色透明凝胶，无颗粒，不析水。
3.3.2.2装量
依法检查（通则0114），应符合规定。
3.3.3化学检定
pH值
应为6.5~8.0（通则0631）。
3.3.4生物学活性
应为标示量的70%~200%（通则3528）。
3.3.5无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
4保存、运输及有效期
于4~25℃避光保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
5使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。