3417 无细胞百日咳疫苗鉴别试验

3417 无细胞百日咳疫苗鉴别试验
（酶联免疫法）
本法系采用酶联免疫法测定无细胞百日咳疫苗有效组分百日咳毒素（PT）和丝状血凝素（FHA）。
试剂 （1）包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液） 称取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加水溶解，定容至1000ml。
（2）磷酸盐缓冲液（pH7.4） 称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml， 121℃灭菌15分钟。
（3）洗涤液（PBS-Tween20） 量取聚山梨酯20（Tween20）0.5ml，加磷酸盐缓冲液稀释至1000ml。
（4）封闭液 称取牛血清白蛋白1.0g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。
（5）稀释液 称取牛血清白蛋白0.5g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。
（6）底物缓冲液（0.005mol/L醋酸钠-枸橼酸缓冲液） 称取醋酸钠0.68g、枸橼酸（C₆H₈O₇?H₂O）1.05g，加水溶解并稀释至1000ml，调pH值至3.6。
（7）底物液A 称取3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）0.08g，加二甲基亚砜40ml溶解，加甲醇60ml，混匀，加底物缓冲液100ml，避光搅拌2小时至完全溶解，室温静置4小时后使用。
（8）底物液B 量取1.5%过氧化氢溶液3.2ml，加底物缓冲液稀释至1000ml。
（9）底物液 取底物液A和底物液B等体积混匀，临用前配制。
（10）终止液 2mol/L硫酸溶液。
阳性对照的制备 用纯化的PT或FHA参考品作阳性对照（2~8μg/ml）。
阴性对照的制备 用PBS或其他适宜的对照品作阴性对照。
供试品溶液的制备 取疫苗供试品适量，加枸橼酸钠或其他适宜的试剂进行疫苗解吸附处理。
测定法 分别取PT抗体或FHA抗体（2~5μg/ml）适量，以100μl/孔加至酶标板内，用封口膜封好，2~8℃放置16~20小时；用洗涤液洗板3次，以200μl/孔加封闭液至酶标板内，用封口膜封好，37℃放置1小时；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次，以100μl/孔加入PT或FHA阳性对照和供试品溶液，37℃放置1小时；用洗涤液洗板6次，稀释辣根过氧化物酶标记的PT抗体或FHA抗体至适当浓度，以100μl/孔加至酶标板内，用封口膜封好，37℃放置1小时；用洗涤液洗板6次，以100μl/孔加入底物液，室温避光放置5~15分钟；以50μl/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在适宜波长处测定吸光度。
结果判定 Cuto ff值为阴性对照吸光度的2.1倍。阳性对照的吸光度应大于Cuto ff值。
供试品溶液的吸光度大于Cuto ff值者为阳性。