1206 细胞色素C活力测定法

1206 细胞色素C活力测定法
试剂 （1）磷酸盐缓冲液（0.2mol/L） 取磷酸氢二钠71.64g，加水使溶解成1000ml，作为甲液。另取磷酸二氢钠27.60g，加水使溶解成1000ml，作为乙液，取甲液81ml与乙液19ml，混匀，调节pH值至7.3。
（2）磷酸盐缓冲液（0.1mol/L） 取磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）500ml，加水稀释至1000ml，调节pH值至7.3。
（3）磷酸盐缓冲液（0.02mol/L） 取磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）100ml，加水稀释至1000ml，调节pH值至7.3。
（4）琥珀酸盐溶液 取琥珀酸与氢氧化钾各4.72g，加水使溶解成100ml，调节pH值至7.3。
（5）氰化钾溶液 取氰化钾0.65g，加水使溶解成100ml后，用稀硫酸调节pH值至7.3。
（6）去细胞色素C的心悬浮液 取新鲜猪（牛）心2只，除去脂肪与结缔组织，切成条，用绞肉机绞碎，置纱布兜中，用水冲洗约2小时（经常搅动，挤出血色素），挤干，用水洗数次，挤干，置磷酸盐缓冲液（0.1mol/L）中浸泡约1小时，挤干，重复浸泡1次，用水洗数次，挤干，置组织捣碎机内，加磷酸盐缓冲液（0.02mol/L）适量恰使猪（牛）心浸没，捣成匀浆，离心10分钟（普通离心机），取上层混悬液，加冰块少量，迅速用稀醋酸调节pH值至约5.5，立即离心15分钟，取沉淀，加等体积的磷酸盐缓冲液（0.1mol/L），用玻璃匀浆器磨匀后，贮存于冰箱中；临用时取1.0ml，加磷酸盐缓冲液（0.1mol/L）稀释至10ml。
供试品溶液的制备 取供试品，加水制成每1ml中含细胞色素C约3mg的溶液。
测定法 取磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）5ml、琥珀酸盐溶液1.0ml与供试品溶液0.5ml（如系还原型制剂，应加入0.01mol/L铁氰化钾溶液0.05ml），置25ml具塞比色管中，加去细胞色素C的心悬浮液0.5ml与氰化钾溶液1.0ml，加水稀释至10ml，摇匀，以同样的试剂作空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在550nm的波长处附近，间隔0.5mn找出最大吸收波长，并测定吸光度，直至吸光度不再增大为止，作为酶还原吸光度；然后各加连二亚硫酸钠约5mg，摇匀，放置约10分钟，在上述同一波长处测定吸光度，直至吸光度不再增大为止，作为化学还原吸光度；按下式计算：

酶还原吸光度
细胞色素C活力= -------------- ×100％
化学还原吸光度