3108 枸橼酸离子测定法

3108 枸橼酸离子测定法
第一法 比色法
枸橼酸钠对照品溶液的制备 取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠（C₆H₅Na₃O₇ ? 2H₂O）0.6g，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置 50ml量瓶中，用5%三氯乙酸稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 精密量取供试品0.5ml与水4.5ml，加10%三氯乙酸溶液5ml，混匀，置60℃水浴加热5分钟，以每分钟4000转离心20分钟，取上清液备用。
测定法 精密量取供试品溶液1ml，置25ml具塞试管中，精密加吡啶1.3ml，混匀，再精密加醋酸酐5.7ml，立即混匀并置31℃±1℃的水浴中，准确放置35分钟后，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在波长425nm处测定吸光度。另精密量取枸橼酸钠对照品溶液0.25ml、0.50ml、0.75ml、1.0ml，分别置于具塞试管中，各精密加5%三氯乙酸溶液0.75ml、0.50ml、0.25ml、0.00ml（其相对应的枸橼酸离子含量为0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L）， 自“精密加吡啶1.3ml”起，同法操作。
以对照品溶液枸橼酸离子浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程，计算出供试品溶液中的枸橼酸离子含量（mmol/L），再乘以供试品稀释倍数（20），即为供试品枸橼酸离子含量（mmol/L）。
第二法 高效液相色谱法
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件 用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子交换色谱柱（H⁺），粒度9μm或8μm，内径7.8mm，柱长 300mm；柱温为50℃；流动相为0.004mol/L硫酸溶液，流速为每分钟0.8ml，示差折光检测器。
测定法 精密称取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠 （C₆H₅Na₃O₇ ? 2H₂O）0.735g，置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，精密量取5.0ml、10.0ml、15.0ml，分别置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得相对应的5.0mmol/L、10.0mmol/L， 15.0mmol/L枸橡酸离子对照品溶液。分别精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液1ml，置15ml离心管中，精密加1.5%磺基水杨酸溶液1ml，混匀，室温下以每分钟2000转离心10分钟。取上清液，同法测定。
以对照品溶液的枸橼酸离子浓度对其相应的峰面积作直线回归，求得直线回归方程，计算出供试品溶液枸橼酸钠含量（mmol/L），再乘以供试品稀释倍数（2），计算出供试品枸橼酸离子含量（mmol/L）。
【附注】（1）根据供试品枸橼酸离子含量，可适当调整枸橼酸离子对照品溶液浓度。
（2）直线回归相关系数应不低于0.999。
（3）不同厂家的阳离子交换色谱柱（H⁺）的流速、流动相、柱温等会有所不同，可根据色谱柱说明书对色谱条件进行适当调整。
第三法 高效液相色谱法
照高效液相色谱法（通则0512）测定。
色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充色谱柱，柱长250mm，柱直径4.6mm，粒度5μm。流动相为18.2mmol/L磷酸盐缓冲液，0.1%异丙醇溶液（pH 2.0～2. 5）；柱温：40℃；流速：每分钟1.0ml；样品池温度：室温；运行时间：50分钟；紫外检测器检测波长：210nm。取5.0mmol/L枸橡酸离子溶液20μl，注入色谱柱，记录色谱图，拖尾因子按枸橼酸离子色谱峰测定应为 0.95～1.40。
测定法 精密称取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠 （C₆H₅Na₃O₇ ? 2H₂O）0.735g，置100ml量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度。精密量取5.0ml、10.0ml、15.0ml，分别置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得相应的5.0mmol/L、10.0mmol/L、15.0mmol/L 枸橼酸离子对照品溶液。分别精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液1ml，置15ml离心管中，精密加1.5%磺基水杨酸4ml，混匀。室温静置2小时以上，以每分钟3000转离心10分钟，取上清液，同法测定。
以对照品溶液枸橼酸离子浓度对其相应的峰面积作直线回归，求得直线回归方程。计算供试品溶液枸橼酸离子含量（mmol/L），再乘以相应的供试品稀释倍数（5），即为供试品枸橼酸离子含量（mmol/L） 。
【附注】（1）根据供试品枸橼酸离子含量，可适当调整枸橼酸离子对照品溶液浓度。
（2）根据供试品蛋白质浓度，可适当调整沉淀剂磺基水杨酸的加入量。
（3）直线回归相关系数应不低于0.999。