注射用A型肉毒毒素

注射用A型肉毒毒素Zhusheyong A Xing Roudu DusuBotulinum Toxin Type A for Injection
本品系用A型肉毒结晶毒素经稀释，加入稳定剂后冻干制成。
1基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2制造
2.1菌种
生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
2.1.1名称及来源
生产用菌种为产毒高的A型肉毒梭菌Hall株或其他A型肉毒梭菌。
2.1.2种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
2.1.3种子批的传代
主种子批应不超过5代，工作种子批应不超过10代。
2.1.4种子批菌种的检定
2.1.4.1形态、培养特性及生化特性
检定菌种可采用明胶琼脂半固体培养基、血琼脂平板培养基、卵黄琼脂平板培养基。
菌种应具有典型的形态特征和培养特性及生化特性，应产生不低于1.0×10^5 LD₅₀/ml的A型肉毒毒素。
2.1.4.2基因稳定性试验
每批工作种子应进行A型肉毒神经毒素基因稳定性试验。菌种神经毒素基因核苷酸序列与基因库中登录号为AF488749的A型肉毒梭菌Hall株的神经毒素基因区核苷酸序列同源性应不低于99.0%。
2.1.5种子批的保存
主种子批和工作种子批均应冻干保存于8℃以下，工作种子批也可接种于适宜培养基，8℃以下保存。
2.2毒素原液
2.2.1生产用种子
启开工作种子批菌种复苏后，在适宜培养基上扩增培养，制备生产用种子。
2.2.2产毒培养基
采用含胰酶消化酪蛋白、酵母透析液（或酵母浸出粉）、葡萄糖培养基，或经批准的其他适宜培养基。
2.2.3接种和培养
生产用种子接种产毒培养基后，在适宜温度培养一定时间。每瓶取样镜检，应无杂菌，经除菌过滤，即为原制毒素，其毒力应不低于1.0×10^5 LD₅₀/ml。
2.2.4结晶毒素
2.2.31纯化及结晶
原制毒素可经等电点沉淀、核糖核酸酶处理、离子交换色谱、硫酸铵浓缩和透析及自然结晶等程序，或用经批准的其他适宜方法进行纯化。纯化毒素经自然结晶后即为结晶毒素。
2.2.4.2保存
于2~8℃避光保存。
2.2.4.3结晶毒素检定按3.1项进行。
2.2.5透析
用PB溶解结晶毒素，经透析去除硫酸铵，除菌过滤后即为原液。
2.2.6原液检定按3.2项进行。
2.3半成品
2.3.1配制
用生理氯化钠溶液或其他适宜稀释液将巳知毒力的毒素溶液稀释至适当浓度，加入适宜稳定剂，使每1ml毒素溶液的毒力在规定范围内。
2.3.2半成品检定按3.3项进行。
2.4成品2.4.1分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2分装及冻干
应符合“生物制品分装和冻干规程”及通则0102有关规定。在冻干过程中制品温度应不高于35℃，真空或充氮封口。
2.4.3规格
每瓶含A型肉毒毒素50U、100U。
2.4.4包装
应符合“生物制品包装规程”及通则0102有关规定。
3检定
3.1结晶毒素检定
3.1.1结晶毒素在普通光学显微镜高倍镜下观察，应呈均一的针状或棒状结晶。
3.1.2毒力测定
可选择下列一种方法进行。毒力应不低于1.0×10^6 LD₅₀/ml。
3.1.2.1本品溶解透析后做适当倍数稀释，按Broff法测定毒力，计算出本品的毒力。即取26~30日龄SPF级昆明小鼠5只，每只尾静脉注射0.1ml本品（或稀释的供试品），求其平均死亡时间（以分钟计），从毒素剂量与死亡时间的标准曲线中求得毒素的毒力。
3.1.2.2按常规方法稀释本品，各稀释度腹腔注射26~30日龄SPF级昆明小鼠4只，每只注射0.5ml，根据动物4天内死亡情况，用统计学方法（Reed-Muench法）计算本品的毒力。
3.1.3纯度测定
3.1.3.1根据波长280nm处吸光度计算的蛋白质浓度及3.1.2项测定的毒力，求出结晶毒素的纯度，每1mg蛋内质纯度应在1.0×10^7 LD₅₀以上。
3.1.3.2波长260nm处吸光度与波长280nm处吸光度之比（A₂₆₀/A₂₈₀）应不高于0.6。
3.1.4特异性检查
取注射用水1ml，溶解A、B、C、D、E、F型冻干肉毒诊断血清，分别于各血清管中加1ml含100 LD₅₀左右的本品。另取2支试管，各加1ml生理氯化钠溶液，再分别加入上述同浓度的本品溶液，其中1支煮沸20分钟作为毒素阴性对照，另1支与混有毒素的诊断血清管同时置37℃结合45分钟，作为毒素阳性对照。各组分别腹腔注射26~30日龄SPF级昆明小鼠2~3只，每只注射0.5ml，观察4日内小鼠死亡情况，A型肉毒毒素判定标准：A型、混合型和阴性对照组小鼠存活，其他型（B、C、D、E、F型）和毒素对照组小鼠死亡，则毒素为A型肉毒毒素。
3.1.5蛋白质图谱
按通则0541 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检查结晶毒素的蛋白组成，在非还原和还原条件下电泳，电泳图谱应与参考品一致。
3.2原液检定
按3.1.2~3.1.4项进行。
3.3半成品检定
无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.4成品检定
除水分测定、装量差异检查外，每瓶加入2.5ml氯化钠注射液，复溶后进行以下检定。
3.4.1鉴别试验
按3.1.4项进行，应符合规定。
3.4.2物理检查
3.4.2.1外观检查
应为白色疏松体，复溶后轻轻摇动，应呈无色或淡黄色澄明液体。
3.4.2.2装量差异依法检查（通则0102），应符合规定。
3.4.2.3可见异物
依法检查（通则0904），应符合规定。
3.4.2.4渗透压摩尔浓度
依法测定（通则0632），应符合批准的要求。
3.4.3化学检定
3.4.3.1水分
应不高于3.0%（通则0832）。
3.4.3.2 pH值
复溶后pH值应在稀释剂pH值的±0.5范围内（通则0631）。
3.4.4效价测定
相对效价应为标示量的80%~120%（通则3533）。
3.4.5无菌检查
依法检查（通则1101），应符合规定。
3.4.6细菌内毒素检查
依法检查（通则1143），应不高于3.5EU/瓶。
4稀释剂
稀释剂为氯化钠注射液，稀释剂的生产应符合批准的要求。
氯化钠注射液应符合本版药典（二部）的相关规定。
5保存、运输及有效期
于2~8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为36个月。
6使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。